甲基對(duì)硫磷降解菌的分離、鑒定及水解酶基因的克隆.pdf

1、利用微生物對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解性能消除其在環(huán)境中的殘留，是治理環(huán)境污染的一項(xiàng)有效手段。甲基對(duì)硫磷(methylparathion，以下簡(jiǎn)稱MP)又稱甲基1605，是一類目前廣泛使用的高毒有機(jī)磷農(nóng)藥，其主要中間代謝產(chǎn)物為對(duì)硝基苯酚(p-nitrophenol，以下簡(jiǎn)稱PNP)，易溶于水，具有中等毒性。由于二者都具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，殘留期很長(zhǎng)，給人類健康造成潛在威脅。本文從華陽(yáng)農(nóng)藥廠污水處理曝氣池中分離，篩選到了多株能降解甲基對(duì)硫磷的菌株。其中菌株

2、Yw12，Yw15，Yw18，Yw28具有較好的降解性能。 Yw12能以甲基對(duì)硫磷為唯一碳源，磷源，對(duì)硝基苯酚為唯一碳源生長(zhǎng)，經(jīng)鑒定，為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumfaciens)。Yw15，Yw18，Yw28，能以甲基對(duì)硫磷和對(duì)硝基苯酚為唯一碳源生長(zhǎng)，經(jīng)鑒定，為蒼白桿菌(Ochzobactetum sp．)四株菌的16S rDNA序列在GetIbank中的注冊(cè)號(hào)分別為DQ468100，DQ468101，DQ4

3、68102和DQ468103。并對(duì)四株菌進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。 分別用氣相色譜法和分光光度法對(duì)四株菌的降解性能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明四株菌在0.5小時(shí)內(nèi)對(duì)50mg/L甲基對(duì)硫磷的降解率達(dá)90％以上；在8小時(shí)內(nèi)能將50mg/L對(duì)硝基苯酚完全降解。四株菌也同時(shí)能夠在以甲胺磷，辛硫磷，毒死蜱，克百威，溴氰菊酯，阿特拉津?yàn)槲ㄒ惶荚吹幕A(chǔ)培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，表明四株菌具有廣泛的農(nóng)藥降解譜。 用多種方法提取四株野生型菌的質(zhì)粒，只有用堿法大量提

4、取時(shí)發(fā)現(xiàn)有比其基因組大的條帶出現(xiàn)，根據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道有的野生型菌株的質(zhì)粒大于其基因組，推測(cè)Yw15，Yw218，Yw28三株菌中可能存在大質(zhì)粒，但用紫外線，電穿孔，變溫SDS等質(zhì)粒消除的方法均沒消除掉，可能條件有待于改進(jìn)。 以四株菌基因組為模板，用PCR法克隆其水解酶基因mpd。將克隆到的菌株Yw12，Yw15，Yw18，Yw28的mpd基因進(jìn)行測(cè)序，其結(jié)構(gòu)基因全長(zhǎng)為998bp，999bp，998bp，999bp?；蜃?cè)號(hào)分別為：

5、DQ843605，DQ843606，DQ843607，DQ843608。測(cè)序結(jié)果在Genebank nucleic-nucleic Blast進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們與其它甲基對(duì)硫磷降解菌的mpd基因同源性高達(dá)99％，說明甲基對(duì)硫磷水解酶結(jié)構(gòu)基因mpd具有非常高的保守性，四株菌的mpd基因可能是甲基對(duì)硫磷水解酶基因的同源基因。四株菌全細(xì)胞粗酶液SDS-PAGE電泳表明，其甲基對(duì)硫磷降解酶在菌體中呈組成型表達(dá)，且初步確定四株野生型菌株MPD水解