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1、本實(shí)驗(yàn)室分離篩選出的微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌( Stenotrophomonas acidaminiphila)G1能夠降解毒死蜱(CP)、甲基對(duì)硫磷(MP)、辛硫磷、二嗪磷、三唑磷(TAP)、丙溴磷。本文將編碼甲基對(duì)硫磷水解酶(MPH)的mpd基因,克隆到大腸桿菌上并成功表達(dá),然后研究了溫度、pH、有機(jī)溶劑甲醇等對(duì)MPH活性的影響,比較G1菌粗酶液與構(gòu)建的大腸桿菌工程菌粗酶液對(duì)CP、MP、TAP的降解效果。
從G1菌中克隆長(zhǎng)度為99
2、6 bp的mpd基因,構(gòu)建重組質(zhì)粒,將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌,獲得基因工程菌株,成功表達(dá)重組蛋白,重組后的 mpd基因編碼的甲基對(duì)硫磷水解酶(MPH),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后蛋白約30 KDa,檢測(cè)其酶活,重組后的蛋白能降解MP。
在研究溫度對(duì)MPH活性影響的時(shí)候,研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度為47℃時(shí),底物MP的降解率最高,說(shuō)明MPH最適反應(yīng)溫度為47℃。在pH對(duì)MP H活性影響的實(shí)驗(yàn)中,在堿性條件下,底物MP的降解率均高于在中性條件下,這說(shuō)
3、明MPH在堿性條件中的活性高,通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MPH的最適反應(yīng)pH為9.1。在研究有機(jī)溶劑甲醇對(duì)MPH的活性影響實(shí)驗(yàn)時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)添加的甲醇在整個(gè)體系的體積比為6%~50%之間時(shí),這可以提高M(jìn)PH的活性,因?yàn)榈孜颩P的降解率明顯要高于不加任何甲醇的對(duì)照,當(dāng)添加的甲醇體積比超過(guò)50%后,MPH的活性被抑制,底物MP的降解很少,降解率小于不添加甲醇的對(duì)照組的降解率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)MP的降解產(chǎn)物PNP對(duì)MPH的活性沒(méi)有影響。
在G
4、1菌粗酶液與大腸桿菌工程菌粗酶液對(duì)兩種農(nóng)藥的降解實(shí)驗(yàn)中,工程菌粗酶液對(duì)C P、TAP的降解率明顯高于G1菌粗酶液,這是因?yàn)闃?gòu)建的工程菌大腸桿菌能夠大量表達(dá)MPH。在添加相同的總蛋白量時(shí),G1菌粗酶液對(duì)CP的降解率高于對(duì)TAP的降解率。將G1菌粗酶液對(duì)MP的降解與G1菌對(duì)MP的降解結(jié)果比較,能夠發(fā)現(xiàn) G1菌在經(jīng)過(guò)16代傳代后,活力明顯下降,克隆的大腸桿菌因其能夠大量表達(dá)甲基對(duì)硫磷水解酶蛋白,所以其對(duì)MP的降解率高。在降解實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)添加的工
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