睪丸酮叢毛單胞菌中17β-HSDX基因的克隆、表達及其酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、分類號：密級：UDC：編號：睪丸酮叢毛單胞菌中17βHSDX基因的克隆、表達及其酶學(xué)性質(zhì)的研究Cloningexpressionenzymologypropertiesresearchofa17betahydroxysteroiddehydrogenaseinComamonastestosteroni學(xué)位授予單位及代碼：長春理工大學(xué)（10186）學(xué)科專業(yè)名稱及代碼：化學(xué)（0703）研究方向：生物與化學(xué)分析申請學(xué)位級別：碩士指導(dǎo)教師：于源

2、華教授研究生：劉凱論文起止時間：2014.09—2015.12摘要睪丸酮叢毛單胞菌是以環(huán)境中的甾體激素作為其生存的唯一碳源和能源，并能夠通過體內(nèi)的一系列酶將甾體激素降解為水和二氧化碳，以此特性而成為研究熱點。短鏈脫氫酶（SDRs）是睪丸酮叢毛單胞菌中一類依賴于NAD(P)H的氧化還原酶，17β羥基類固醇脫氫酶是SDR超級家族成員之一，其主要功能是催化類固醇的羥基酮基的氧化還原。本文成功從睪丸酮叢毛單胞菌ATCC11996中克隆出17β羥

3、基類固醇脫氫酶（17βHSDX）基因，構(gòu)建了重組表達載體pET15b17βHSDX，將重組表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，成功表達并通過Ni柱親和層析的方法純化了17βHSDX蛋白，分子量約為27.2KDa，純化后濃度為2.64mgmL。17βHSDX基因包含750bp堿基，編碼249個氨基酸組成。利用純化后的蛋白免疫兔子，制備了效價為1：16000的17βHSDX多克隆抗體，并建立了測定17βHSDX的標準曲線。分別用睪丸酮、雌酮、

4、雌二醇、雌三醇來誘導(dǎo)睪丸酮叢毛單胞菌，用Elsia方法分別測定了17βHSDX蛋白的表達量，發(fā)現(xiàn)在睪丸酮和雌酮進行誘導(dǎo)時17βHSDX蛋白的表達量較高。利用同源重組的方法敲除17βHSDX基因，成功獲得17βHSDX缺失的突變菌株。利用高效液相色譜法對突變型與野生型菌株的培養(yǎng)基中四種誘導(dǎo)激素的殘留量進行檢測，在睪丸酮和雌酮的誘導(dǎo)下，野生型和突變型的培養(yǎng)基中兩種激素的殘留量差值最為明顯。因此17βHSDX對降解睪丸酮和雌酮起到了重要作用。