脂肪酶基因的克隆表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、本研究從廣西武鳴縣采取的土樣中篩選到一株產(chǎn)脂肪酶的野生菌株，通過16S rDNA序列的同源性比對和建立系統(tǒng)發(fā)育樹分析，初步鑒定該菌株屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），并命名為STL-01。利用PCR技術(shù)分別從STL-01和本實(shí)驗(yàn)室保藏并已完成全基因組測序的鏈霉菌GXT-6(CICC11021)中各克隆到一個(gè)脂肪酶基因，分別命名為lip1和lip3。
　　分別將lip1和lip3兩個(gè)基因與表達(dá)載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后

2、導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)鎳柱親和層析純化獲得重組脂肪酶后進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析。結(jié)果表明:重組脂肪酶Lip1在25℃具有最高活力，在0℃和10℃時(shí)有32.5％和70.2％的相對活力;最適pH為8.0，在pH6.0-9.0范圍內(nèi)有較高的酶活力;最適底物為C8（pNPH/對硝基苯酚辛酸酯），且作用的底物范圍較廣，對C2-C16都有一定的水解能力;5mM的Ba2+、Zn2+、Ni2+、Ca2+、Fe3+對其有很明顯的抑制作用，1％(w/v)的離子

3、型表明活性劑SDS和CTAB幾乎完全抑制其水解活力，能耐受10％(v/v)的乙醇、1，2-丙二醇、丙酮、正己烷、DMF及15％(v/v)的甲醇。重組脂肪酶Lip3在40℃具有最大活性;最適pH為7.0，在pH5.5-10.0范圍內(nèi)有很好的穩(wěn)定性;最適底物為C2（pNPA/對硝基苯酚乙酸酯），同時(shí)對C6（pNPH/對硝基苯酚己酸酯）有非常強(qiáng)的水解作用，5mM的Zn2+幾乎完全抑制其水解活力，能夠耐受10％(v/v)的乙醇、1，2-丙二醇、