油菜脂肪酶基因的克隆及表達(dá)研究.pdf

1、脂肪酶是一個(gè)超級(jí)基因家族，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。脂肪酶主要分為兩類，即GXSXG脂肪酶和GDSL脂肪酶。GDSL脂肪酶具有脂水解活性，在食品、香料、化妝品等行業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。而且，植物中GDSL脂肪酶可能在調(diào)控植物生長(zhǎng)和發(fā)育中扮演重要角色。油菜是十字花科油料作物，研究油菜中GDSL脂肪酶在油脂代謝過程中的作用將有助于揭示其與植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系，同時(shí)也為油菜脂肪酶的應(yīng)用打下理論基礎(chǔ)。 本研究通過對(duì)擬南芥GDSL脂肪酶

2、基因及其蛋白編碼序列的生物信息學(xué)分析、油菜GDSL脂肪酶基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆和表達(dá)，以及對(duì)BnLIPl基因進(jìn)行原核表達(dá)等研究，得出以下結(jié)果： 1)對(duì)擬南芥GDSL脂肪酶基因及其編碼的氨基酸序列的生物信息學(xué)特征進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。基于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的資源，獲得了99個(gè)擬南芥GDSL脂肪酶基因，對(duì)應(yīng)107個(gè)非冗余cDNA序列。研究結(jié)果顯示，它們的基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分別含有1～13個(gè)內(nèi)含子，而且內(nèi)含子大小從幾十bp到1kb不等。這些

3、基因在擬南芥染色體上呈無(wú)規(guī)律分布，有的GDSL脂肪酶基因在染色體的某些區(qū)域如染色體I的短臂近著絲點(diǎn)區(qū)域、長(zhǎng)臂中部及近端粒區(qū)域集中分布，也有的基因在染色體上呈串聯(lián)分布。序列同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，編碼不同GDSL脂肪酶蛋白的氨基酸序列具有相對(duì)保守的區(qū)域，但是序列之間的同源性并不高。在進(jìn)化關(guān)系上，擬南芥GDSL脂肪酶分為三組，分別由28、40和39個(gè)成員組成。通過結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥中大部分GDSL脂肪酶具有典型的GDSL脂肪酶的特征，即它們的G

4、DSL脂肪酶結(jié)構(gòu)域靠近N一端，前面的氨基酸序列可能作為信號(hào)肽介導(dǎo)蛋白的分泌。但是，個(gè)別GDSL脂肪酶的GDSL結(jié)構(gòu)域在N-端或位于蛋白序列的中部，而有的氨基酸序列中同時(shí)具有多個(gè)GDSL脂肪酶的結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，有99個(gè)脂肪酶的N一端含有長(zhǎng)度為6～113個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，它們可能負(fù)責(zé)介導(dǎo)蛋白定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后分泌到細(xì)胞的其它部位甚至胞外。另有2個(gè)GDSL脂肪酶蛋白很可能分別定位到線粒體和葉綠體，4個(gè)蛋白中沒有明確的亞細(xì)胞

5、定位信號(hào)。由此可見，擬南芥GDSL脂肪酶的確是一個(gè)大家族，各成員在序列、基因結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域的位置、亞細(xì)胞定位特征等方面都具有不同程度的多樣性。擬南芥的大部分GDSL脂肪酶基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，序列同源性不高，GDSL脂肪酶結(jié)構(gòu)域靠近N一端，而且具有分泌信號(hào)?；谀壳暗难芯繄?bào)道，這些GDSL脂肪酶很可能在擬南芥的種子萌發(fā)、花發(fā)育及抗逆反等過程中發(fā)揮重要作用。 2)從油菜種子萌發(fā)的黃化幼苗中克隆了BnLIPl全長(zhǎng)cDNA，其大小為1318bp

6、，推導(dǎo)該序列編碼一個(gè)含389個(gè)氨基酸殘基、分子量為43.32kDa的蛋白。BnLIPl基因序列與擬南芥GDSL脂肪酶基因序列具有較高的同源性，其中與Arab-1的同源性達(dá)70％；而在氨基酸水平上BnLIPl蛋白與Arab-1的同源性達(dá)82％。通過氨基酸序列的多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)，BnLIPl的氨基酸序列與部分已報(bào)道的植物GDSL脂肪酶具有多個(gè)保守的區(qū)域，其中含有絲氨酸活性位點(diǎn)的GDSL-motif靠近蛋白的N-端，該motif中Ile-42取代

7、了Leu；同時(shí)推測(cè)Ser-41、Asp-180、His-348三者組成具有催化活性的三聯(lián)體。由此可見，所獲得的cDNA編碼的蛋白具有GDSL脂肪酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)特征，而且該蛋白具有GDSL脂肪酶結(jié)構(gòu)域，因此推測(cè)BnLIPl是GDSL脂肪酶家族的成員。預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，BnLIPl蛋白具有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，其在進(jìn)化上與擬南芥Group Ⅲ的成員尤其是Arab-1的親緣關(guān)系最近，屬于Group Ⅲ蛋白家族。此外，還克隆了該基因的基因組序列，該序列長(zhǎng)度

8、為1601bp，含有4個(gè)內(nèi)含子，與擬南芥中的大多數(shù)GDSL脂肪酶基因類似，其基因結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜。同時(shí)，Southern雜交分析表明其很可能以多拷貝的形式存在于油菜基因組中。 組織器官表達(dá)分析結(jié)果表明，BnLIPl基因在油菜休眠種子以及萌發(fā)后3天之前的材料中不表達(dá)，而從萌發(fā)后第3天開始該基因有強(qiáng)烈的表達(dá)。具體而言，萌發(fā)第3天和第4天的表達(dá)水平穩(wěn)定，到萌發(fā)第5天時(shí)的表達(dá)量最大，隨后則趨于減弱，BnLIPl基因的表達(dá)隨種子萌發(fā)而發(fā)生變

9、化。因此，BnLIPl基因很可能參與了種子萌發(fā)過程中的代謝活動(dòng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)其在成熟植株的不同組織器官中的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的差異，在根和未成熟的果莢中的表達(dá)明顯弱于其它組織器官中的表達(dá)，而在花和花蕾中的表達(dá)量很高，這說(shuō)明BnLIPl基因可能在植株的開花、果莢發(fā)育等過程中發(fā)揮重要的作用。因此，BnLIPl基因不僅僅與種子萌發(fā)有關(guān)，還可能參與成花、開花、果莢發(fā)育等生理過程。這說(shuō)明BnLIPl編碼的脂肪酶很可能參與油脂的基礎(chǔ)代謝，而不同于萌發(fā)階段

10、特異表達(dá)的脂肪酶。 3)從油菜種子萌發(fā)的黃化幼苗中克隆了BnLIP2基因的全長(zhǎng)cDNA，其大小為1300bp，推導(dǎo)該序列編碼一個(gè)含有373個(gè)氨基酸殘基、分子量為41.27kDa的蛋白。BLASTn分析表明，其cDNA序列與擬南芥GDSL脂肪酶基因的同源性為63.5％，而與Arab-1和BnLIPl的同源性較低。此外，與看麥娘脂肪酶基因、水稻脂肪酶基N(GenBank Acc.No.ACl24150)的同源性很低。BnLIP2蛋白

11、的氨基酸序列與擬南芥GDSL脂肪酶(Acc.Nos.NP 174179，NP 174188)的同源性分別為77.5％和59.5％，與油菜(AAX58135)、水稻(AAS91011)、看麥娘(CAG27610)、燕麥(AAT11017)、蘿芙木(AAW88320)的GDSL脂肪酶的同源性分別為59％、47.6％、46.5％、39％和37％。此外，與洋地黃、苜蓿、橡膠樹等物種的GDSL脂肪酶具有較低的同源性。氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果顯示，與

12、BnLIPl類似，BnLIP2同樣具有GDSL脂肪酶的保守區(qū)序列，靠近N-端的GDSL-motif中Ile-37取代了Leu，其具有催化活性的三聯(lián)體可能由Ser-36，Asp-174(或Asp-326)和His-329組成。推測(cè)BnLIP2蛋白屬于GDSL脂肪酶家族。在氨基酸水平上，BnLIP2與BnLIPl只有59％的同源性，表明它們由不同的GDSL脂肪酶基因編碼。此外，BnLIP2蛋白中同樣含有GDSL脂肪酶結(jié)構(gòu)域(PF00657)

13、，在進(jìn)化上也屬于Group III家族，而且與擬南芥GDSL脂肪酶(Acc.No.NP-174179)的進(jìn)化關(guān)系最近，在進(jìn)化上與BnLIPl也較近。分析發(fā)現(xiàn)，在Group III家族成員中，分類地位越近的物種，其GDSL脂肪酶的進(jìn)化關(guān)系也越近，比如十字花科中擬南芥和油菜的GDSL脂肪酶，禾本科植物小麥和燕麥的GDSL脂肪酶等。Southern雜交分析結(jié)果表明BnLIP2基因?yàn)榈涂截惢颉?利用半定量RT-PCR對(duì)BnLIP2基

14、因進(jìn)行了表達(dá)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在萌發(fā)3天之前的樣品中未檢測(cè)到BnLIP2基因的表達(dá)，其表達(dá)開始出現(xiàn)在萌發(fā)3天(3DAG)的樣品中，在這一點(diǎn)上BnLIP2基因與BnLIPl基因相似。然而，在種子萌發(fā)后期二者的表達(dá)特征具有明顯的差異。BnLIP2基因的表達(dá)在萌發(fā)后第3天到第5天維持較弱的水平，直到萌發(fā)后第6天該基因的表達(dá)量劇增；而BnLIPl基因在萌發(fā)后第3天和第4天的表達(dá)量很高，其表達(dá)在萌發(fā)第5天時(shí)達(dá)到最高值。可見，種子萌發(fā)期間BnLIP2

15、基因的大量轉(zhuǎn)錄發(fā)生在BnLIP1基因之后，而且轉(zhuǎn)錄高峰也相應(yīng)滯后。這意味著兩個(gè)基因都參與了種子萌發(fā)過程，但其表達(dá)具有時(shí)間特異性。在成熟植株的不同組織器官中BnLIP2基因的表達(dá)也具有明顯差異。BnLIP2基因在莖、葉、花、未成熟的果莢，以及花蕾等組織中都有表達(dá)，其中在花蕾中的表達(dá)量最高，其次是在發(fā)育的果莢中，再次是在花和葉中，而在莖中的表達(dá)最弱。然而，BnLIP1基因在果莢中的表達(dá)最弱，而在莖中的表達(dá)量高。更有意思的是，在成熟植株的根中

16、檢測(cè)不到BnLIP2基因的表達(dá)，而．BnLIP1基因在根中有明顯的表達(dá)。這些研究表明，二者在成熟植株不同組織器官中，尤其是在根中的表達(dá)差異明顯。同時(shí)，在正常生長(zhǎng)幼苗的根中同樣檢測(cè)不到BnLIP2基因的表達(dá)。這說(shuō)明BnLIP2基因在植株正常生長(zhǎng)發(fā)育條件下很可能并不參與根的生長(zhǎng)和發(fā)育。 為了進(jìn)一步研究BnLIP2基因在根中的表達(dá)情況，用甲基茉莉酸(MeJA)、水楊酸(SA)和萘乙酸(NAA)對(duì)4周齡幼苗的根部分別進(jìn)行了處理，結(jié)果未檢

17、測(cè)到該基因在根部的表達(dá)。由此可見，上述誘導(dǎo)子并不能誘導(dǎo)BnLIP2基因在植株根中的表達(dá)。因此BnLIP2基因很可能并不參與在上述誘導(dǎo)子對(duì)根部的誘導(dǎo)反應(yīng)。這是首次揭示油菜中GDSL脂肪酶基因的這一特性，特別是發(fā)現(xiàn)了BnLIP2基因在根中不表達(dá)的現(xiàn)象，而且其表達(dá)也不受某些誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)。上述組織器官表達(dá)分析表明，BnLIP1基因可能比BnLIP2基因在油菜植株的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮更廣泛的作用。 4)為了進(jìn)一步研究BnLIPl基因的功能，構(gòu)

18、建了含BnLIPl基因的pET32a(+)大腸桿菌表達(dá)載體，在大腸桿菌中成功表達(dá)了BnLIPl蛋白，首次實(shí)現(xiàn)了油菜GDSL脂肪酶基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)。 綜上，本研究表明，擬南芥GDSL脂肪酶基因是一個(gè)大家族，各成員之間具有明顯的多樣性，而Group III的成員可能在種子萌發(fā)過程中發(fā)揮重要作用。本研究從油菜種子萌發(fā)的黃化幼苗中克隆了屬于GDSL脂肪酶基因家族的基因BnLIPl和BnLIP2，并對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)研究，為進(jìn)一步研究其