硝酸還原酶基因的克隆、表達調控及油菜轉化的研究.pdf

1、硝酸鹽作為強致癌物-亞硝胺的前體，對人體健康的潛在威脅已受到世界各國的廣泛關注。研究資料表明，人體攝入的硝酸鹽80％以上來自蔬菜，而蔬菜又在人們日常生活中不可缺少。因此，解決蔬菜硝酸鹽污染對人體健康具有重要的意義。硝酸還原酶(NR)是植物氮代謝的關鍵酶，也是限速酶。硝酸還原酶活性(NRA)代表了植物還原硝酸鹽的能力，提高NRA可以加速植物體內硝酸鹽的同化，從而減少植物體內硝酸鹽的積累。本研究旨在克隆硝酸還原酶基因，研究NR基因在植物體內

2、的表達，構建NR基因的過量表達載體，研究遺傳轉化油菜過程中使用抗生素的濃度，在油菜中過量表達硝酸還原酶活性以降低油菜體內的硝酸鹽含量。以此來探索解決蔬菜硝酸鹽污染問題的途徑。主要研究結果和結論如下：
　　 1.硝酸還原酶(NR，EC.1.6.6.1)是硝酸鹽同化過程中的關鍵酶，也是限速酶。以經(jīng)10mmol/LKNO3誘導2h的番茄根和葉為材料，采用RT-PCR技術克隆了番茄硝酸還原酶基因的全長cDNA序列。此序列全長2736bp

3、，編碼一個由911個氨基酸殘基組成的蛋白質，其編碼蛋白質的相對分子質量為102.4kDa，理論等電點為6.88。比較番茄NR與其它十幾種植物NR的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，植物的NR基因比較保守。
　　 2.采用Northern雜交技術和硝酸還原酶體內活力測定法，研究了光和硝酸鹽對番茄幼苗根和葉中硝酸還原酶(NR)基因轉錄水平和酶活的調控。試驗發(fā)現(xiàn)番茄硝酸還原酶基因的轉錄和酶活存在組織間差異。無光時，硝酸鹽誘導番茄根中NR基因的轉錄大于葉

4、中NR基因的轉錄。光和硝酸鹽共同作用時，低濃度的硝酸鹽可誘導番茄根、葉NR基因的轉錄，而高濃度的硝酸鹽則抑制葉中NR基因的轉錄。硝酸鹽對葉中硝酸還原酶活性的誘導大于光對其的誘導，在根中卻相反。光和硝酸鹽兩個因素的協(xié)同效應大于單個因素對番茄硝酸還原酶活性的調控。相同條件下番茄根、葉NR基因的轉錄與NRA的變化規(guī)律不一致。
　　 3.構建攜帶35S啟動子的植物雙元表達載體pCAMBIA1300-35S，并將克隆到的番茄全長cDNA插

5、入這個表達載體。轉化農(nóng)桿菌LBA4404。
　　 4.考察了Kan、PPT、Hyg三種抗生素對寧油12、14、16號甘藍型油菜品種種子萌發(fā)和幼苗生長的影響以及這些品種對這三種抗生素的耐受性。結果發(fā)現(xiàn)，Kan主要影響油菜葉綠素的合成，而PPT和Hyg主要影響油菜下胚軸的伸長。Kan對寧油12、14、16號的最低抑制濃度分別為50mg/L、100mg/L、150mg/L。而PPT和Hyg對寧油12、14、16號的最低抑制濃度均為20