甘藍(lán)型油菜脂肪酰-CoA還原酶基因家族成員的克隆、表達(dá)分析與載體構(gòu)建.pdf

1、植物角質(zhì)層蠟質(zhì)具有多種生理和生態(tài)功能，是植物抵御外界環(huán)境脅迫的第一道屏障。角質(zhì)層蠟質(zhì)主要由超長鏈脂肪酸、烷類、醛類、酸類、醇類、酮類和酯類等組成。脂肪酰-CoA還原酶(fatty acyl-CoA reductase，F(xiàn)AR)負(fù)責(zé)催化蠟質(zhì)組分一級醇類的合成。本研究分離克隆了甘藍(lán)型油菜FAR基因BnCER4-1、BnCER4-2、BnCER4-3、BnCER4-4，并對它們進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；研究了BnCER4家族成員的組織器官特異性表

2、達(dá)以及激素誘導(dǎo)表達(dá)模式；比較了它們在有蠟粉、無蠟粉材料中的差異表達(dá)；構(gòu)建了BnCER4-4的超表達(dá)載體和RNAi載體，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用電子克隆與RT-PCR技術(shù)獲得了甘藍(lán)型油菜FAR基因的四個ORF序列，分別命名為：BnCER4-1（基因登錄號：KT795333）、BnCER4-2（基因登錄號：KT795334）、BnCER4-3（基因登錄號：KT795335）、BnCER4-4（

3、基因登錄號：KT795336）。其中BnCER4-1與BnCER4-2的ORF（包括終止密碼子）為1479 bp，編碼492個氨基酸殘基，而BnCER4-3與BnCER4-4的ORF為1482 bp，編碼493個氨基酸殘基。BnCER4-1、BnCER4-2、BnCER4-3、BnCER4-4的GC含量分別是41.58％、41.58%、41.36%、41.50%。BLASTn、氨基酸序列多重比對表明這4個基因與預(yù)測的白菜、甘藍(lán)的FAR基

4、因同源性最高，其次是擬南芥、亞麻薺。預(yù)測的四個基因前體蛋白二級結(jié)構(gòu)主要是α-螺旋（38.62%-42.39%），無規(guī)則卷曲（25.20%-26.17%）和延伸鏈（21.91%-25%）較少，β轉(zhuǎn)角(9.53%-10.77%)比例最低。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)BnCER4-1、BnCER4-2、BnCER4-3和BnCER4-4均可能位于葉綠體。預(yù)測的四個前體蛋白在N端都有一個結(jié)合NAD(P)H的Rossmann折疊結(jié)構(gòu)域，并含有保守序列GXXGX

5、X(G/A)及YXXXK，在C端有一個脂肪酰CoA還原酶結(jié)構(gòu)域，符合植物FAR蛋白結(jié)構(gòu)特征。⑵qRT-PCR檢測結(jié)果表明，甘藍(lán)型油菜 BnCER4家族成員表達(dá)存在組織器官特異性。BnCER4-1/2在葉片中的表達(dá)量最高，其次是莖，在角果和花中表達(dá)量較低，而在根中幾乎不表達(dá)。BnCER4-3/4也是在葉片中表達(dá)量最高，其次是角果、莖、花，其中BnCER4-3在根中不表達(dá)，BnCER4-4在根中有少量表達(dá)。這表明BnCER4的幾個家族成員可

6、能活躍地參與了甘藍(lán)型油菜地上部分組織器官角質(zhì)層蠟質(zhì)的沉積，其中BnCER4-1/2在葉片的蠟質(zhì)沉積中起主要作用，而BnCER4-3/4可能普遍參與了地上部分組織器官的蠟質(zhì)合成。對 BnCER4家族成員在有蠟粉與無蠟粉材料莖、葉中的差異表達(dá)分析結(jié)果表明，BnCER4-1/2在中雙11和無蠟粉材料莖中的表達(dá)無顯著差異，而 BnCER4-3/4在中雙11莖中的表達(dá)顯著高于無蠟粉材料。BnCER4-1/2與 BnCER4-3/4在無蠟粉材料葉片

7、中的表達(dá)量均顯著下調(diào)，其中BnCER4-4在無蠟粉材料的葉片中不表達(dá)。這表明植株蠟質(zhì)沉積的減少與BnCER4家族成員的轉(zhuǎn)錄下調(diào)有關(guān)。外源激素 SA、MeJA及 ACC處理不同程度地誘導(dǎo)了BnCER4-1/2在甘藍(lán)型油菜中雙9與渝油19中的表達(dá)。⑶設(shè)計了帶有SacI/XmaI酶切位點序列的PCR引物，從油菜總cDNA中擴增獲得BnCER4-4的全長編碼序列，經(jīng)測序驗證正確后，利用XmaI+SacI雙酶切技術(shù)將編碼序列最終克隆到pCambi

8、a2301G載體上，得到了攜帶目的基因的重組載體pCambia2301G-BCER4-4，依次轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α及根癌農(nóng)桿菌LBA4404，經(jīng)過PCR及酶切鑒定后獲得了攜帶BnCER4-4的工程菌株。根據(jù)BnCER4-3/4的保守區(qū)域設(shè)計RNAi片段引物，克隆了284 bp的甘藍(lán)型油菜BnCER4-3/4基因家族特異的RNA干擾片段，利用NcoI+AatII雙酶切將反義片段亞克隆到植物 RNA干擾基礎(chǔ)載體 pFGC5941M的啟動子與