甘藍(lán)型油菜及其親本物種BAN基因家族的克隆與比較基因組學(xué)分析.pdf

1、甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)是我國(guó)最重要的油料作物之一,其黃籽類型與黑籽類型相比有著許多品質(zhì)優(yōu)勢(shì),黃籽性狀是國(guó)內(nèi)外油菜育種的熱點(diǎn)之一。雖然作為甘藍(lán)型油菜的親本物種白菜型油菜(B.rapa)和甘藍(lán)(Brassicaoleracea)都有天然的表現(xiàn)穩(wěn)定的黃籽類型,但它沒(méi)有,而通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交等方法創(chuàng)造黃籽材料的選育周期長(zhǎng)、效率低,尤其是黃籽表型易受環(huán)境影響而不穩(wěn)定。當(dāng)前急需對(duì)甘藍(lán)型油菜和其親本物種中與黃籽性狀相關(guān)的重要功能基因進(jìn)行全

2、長(zhǎng)序列的比較克隆,然后進(jìn)行比較研究,揭示這3個(gè)物種間在黃籽性狀上的分子遺傳學(xué)機(jī)理,并通過(guò)基因工程改良甘藍(lán)型油菜的籽色性狀。
　　 甘藍(lán)型油菜黃籽性狀形成的分子機(jī)理目前還不清楚,但可以借鑒同屬于十字花科的擬南芥透明種皮(TRANSPARENTTESTA,TT)性狀研究的成果?；ㄇ嗨剀蘸涂s合單寧的合成共用的是一種底物,而由BANYULS(BAN)基因編碼的花青素還原酶(Anthocyanidinreductase,ANR)正是在類黃

3、酮物質(zhì)合成途徑中決定這種底物是否轉(zhuǎn)向縮合單寧合成的關(guān)鍵酶。BAN將花青素還原為2,3-順式-黃酮-醇的功能,隨后2,3-順式-黃酮-3-醇聚合成為縮合單寧。研究甘藍(lán)型油菜及其2個(gè)親本物種的BAN基因有助于進(jìn)一步研究甘藍(lán)型油菜黃籽性狀形成的分子機(jī)制,為通過(guò)遺傳工程創(chuàng)造穩(wěn)定的甘藍(lán)型黃籽油菜新材料提供基礎(chǔ)。
　　 本研究克隆了甘藍(lán)型油菜BAN基因家族(BnBAN)的3個(gè)成員、白菜型油菜BAN基因家族(BrBAN)的2個(gè)成員和甘藍(lán)BAN

4、基因家族的2個(gè)成員(BoBAN)的cDNA序列及其基因組全長(zhǎng)序列,并進(jìn)行了系統(tǒng)分析,主要結(jié)果如下:
　　 1)率先克隆了甘藍(lán)型油菜及其2個(gè)親本物種的BAN基因家族本研究利用RACE技術(shù),率先獲得了甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜型油菜和甘藍(lán)的BAN基因家族部分成員全長(zhǎng)cDNA和對(duì)應(yīng)的基因組序列。BnBAN-1、BnBAN-2和BnBAN-3分別為1571bp、1612bp和1574bp,推導(dǎo)的mRNA分別為1178bp、1124bp和

5、1180bp(不計(jì)poly(A)尾巴,下同)；BrBAN-1和BrBAN-2分別為1607bp和1623bp,推導(dǎo)的mRNA分別為1212bp和1174bp；BoBAN-1和BoBAN-2分別為1543bp和1642bp,推導(dǎo)的mRNA分別為1172bp和1150bp。這是在蕓薹屬植物中首次克隆全長(zhǎng)BAN基因,為深入研究蕓薹屬植物BAN基因的功能、進(jìn)化、調(diào)控模式奠定了基礎(chǔ)。
　　 2)蕓薹屬BAN基因具有BAN的典型特征蕓薹屬7

6、個(gè)BAN基因都有5個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子,符合GT……AG的內(nèi)含子邊界序列特征,并且和AtBAN的位置相符。在BnBAN-1、BnBAN-2、BnBAN-3、BrBAN-1、BrBAN-2、BoBAN-1和BoBAN-2mRNA的41-1069、50-1066、41-1078、74-1111、46-1062、47-1063、41-1069bp區(qū)段有分別為1029、1017、1038、1038、1017、1017、1017bp的開(kāi)放閱讀框(

7、ORF,包括終止密碼子),5’UTR分別為40、49、40、73、45、46、40bp,3’UTR分別為109、58、102、101、112、87、103bp。分別在它們polyA加尾位點(diǎn)上游的22-42、23-43、22-42、20-39、20-42、15-34、22-45bp有可能的非典型polyA加尾信號(hào)TATAAA和AAATAAT。
　　 BnBAN-1、BnBAN-2、BnBAN-3、BrBAN-1、BrBAN-2、B

8、oBAN-1和BoBAN-2分別編碼由342、338、345、345、338、342、338個(gè)氨基酸組成的多肽鏈,理論分子量(Mw)分別為37.850、37.680、38.277、38.266、37.614、37.927和37.554,等電點(diǎn)(pI)分別為6.38、4.93、6.38、6.06、5.00、5.81和4.87。它們都編碼酸性蛋白,氨基酸組成中絲氨酸的含量均為最高。BnBAN-1、BnBAN-3和BrBAN-1有24個(gè)潛在的

9、磷酸化位點(diǎn),BnBAN-2、BrBAN-2和BoBAN-2都有18個(gè),BoBAN-1有23個(gè)。預(yù)測(cè)它們均沒(méi)有信號(hào)肽和跨膜域,可能象AtBAN一樣定位于細(xì)胞質(zhì)中。
　　 蕓薹屬3個(gè)物種的7個(gè)BAN蛋白與AtBAN和苜蓿BAN一樣,也具有典型的羅斯曼折疊,表現(xiàn)在都具有一個(gè)保守的富含谷氨酸的序列GXXGXXA,在該序列中它們均有同已報(bào)道的擬南芥中決定BAN底物特異性的氨基酸N21和L22對(duì)應(yīng)的殘基,同時(shí)在這7個(gè)蛋白均存在一個(gè)與AtBA

10、N高度相似的亮氨酸拉鏈。它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似,以α螺旋所占比例最高,占氨基酸總數(shù)的39.77～42.60％,隨機(jī)卷曲占30.04"--32.84％,有少量的延伸鏈和β轉(zhuǎn)角。它們蛋白的中部都有2個(gè)大的α螺旋,C末端也有1個(gè)。它們的三級(jí)結(jié)構(gòu)也很相似,與葡萄黃烷酮醇還原酶的晶體整體相似,與赭色擲孢酵母的NADPH依賴型羥基還原酶部分相似。
　　 從基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、序列同源性三大方面分析,均顯示蕓薹屬3個(gè)物種的7個(gè)BAN基因是At

11、BAN的垂直同源基因,具有BAN的典型特征。
　　 3)甘藍(lán)、白菜型油菜為甘藍(lán)型油菜提供了遺傳物質(zhì)BnBAN-1和BoBAN-1之間基因組序列和編碼區(qū)序列的一致性分別高達(dá)97.5％和99.1％。BnBAN-2和BoBAN-2之間基因組序列和編碼區(qū)序列的一致性分別高達(dá)96.5％和99.5％。這些種間基因的一致性高于甘藍(lán)型油菜種內(nèi)成員之間的一致性。無(wú)論核酸水平還是氨基酸水平的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)聚類結(jié)果,內(nèi)含子的相似度,基因序列和氨基酸序列上

12、的特異位點(diǎn)均顯示,BnBAN-1和BoBAN-1緊密地聚在一起,BnBAN-2和BoBAN-2緊密地聚在一起?？梢源_定BnBAN-1和BnBAN-2來(lái)自于甘藍(lán)(BoBAN-1和BoBAN-2)。甘藍(lán)和白菜型油菜的確為甘藍(lán)型油菜提供了遺傳物質(zhì)。本研究從編碼關(guān)鍵酶的功能基因家族成員的全長(zhǎng)序列比較克隆的角度,為揭示甘藍(lán)型油菜與其親本物種間的進(jìn)化關(guān)系提供了直觀而具體的分子證據(jù)。
　　 4)甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜和甘藍(lán)BAN基因家族的成員

13、數(shù)采用甘藍(lán)型油菜典型黑籽系5B的基因組DNA為材料,分別用EcoRI、EcoRV、SphI、SacI、XbaI這5種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切和Southernblot雜交,結(jié)果顯示BnBAN家族可能存在4個(gè)以上成員。由于這3個(gè)物種BAN基因家族全部成員克隆工作尚未完成,且沒(méi)有對(duì)白菜型油菜和甘藍(lán)的BAN基因進(jìn)行Southern雜交,因此有待于進(jìn)一步的進(jìn)行竭盡式的克隆,才能回答蕓薹屬二倍體基因種相對(duì)于擬南芥在BAN功能位點(diǎn)究竟是否符合典型的“三