甘藍(lán)型油菜及其親本物種PAP基因家族的克隆與比較基因組學(xué)研究.pdf

1、本研究克隆了甘藍(lán)型油菜及其2個(gè)親本物種的PAP基因家族共12個(gè)基因成員的全長(zhǎng)cDNA和基因組序列，進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)分析。
　　 1)甘藍(lán)型油菜及其親本物種PAP基因家族的全長(zhǎng)序列克隆及基因的結(jié)構(gòu)特征
　　 本研究采用RACE技術(shù)，率先克隆了甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜型油菜和甘藍(lán)PAP基因家族共12個(gè)基因成員的全長(zhǎng)cDNA和基因組序列。
　　 甘藍(lán)型油菜BnPAP基因家族的6個(gè)成員：BnPAP1

2、、BnPAP2、BnPAP3、BnPAP4、BnPAP5、BnPAP6的基因全長(zhǎng)分別為1793、1804、1979、1541、1522、1956bp，它們的實(shí)測(cè)最長(zhǎng)版本mRNA全長(zhǎng)分別為872、1011、1001、873、1005(推導(dǎo))、1003bp(不計(jì)poly(A)尾巴，下同)。
　　 白菜型油菜BrPAP基因家族的3個(gè)成員：BrPAP1、BrPAP2、BrPAP3的基因全長(zhǎng)分別為1854、1515、1973bp，它們的實(shí)

3、測(cè)最長(zhǎng)版本mRNA全長(zhǎng)分別為932、998(推導(dǎo))、1001bp。
　　 甘藍(lán)BoPAP基因家族的3個(gè)成員：BoPAP1、BoPAP2、BoPAP3的基因全長(zhǎng)分別為1548、1792、1957bp，它們的實(shí)測(cè)最長(zhǎng)版本mRNA全長(zhǎng)分別為873、1001、1000bp。
　　 蕓薹屬3個(gè)物種的12條PAP基因均由2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子組成，所有內(nèi)含子都符合GT...AG的內(nèi)含子剪切位點(diǎn)邊界序列特征。除BnPAP5和BrPAP

4、2外，它們的mRNA均具有一個(gè)744～753bp的ORF(開放讀框，含終止密碼子)，5'UTR為32～86bp，3'UTR為93～181bp。最末poly(A)加尾位點(diǎn)上游均存在1～2處典型的poly(A)加尾信號(hào)AAATAAA。BnPAP5和BrPAP2由于在第6位氨基酸處發(fā)生了提前終止突變，使ORF只有18bp。發(fā)生提前終止突變之前，BnPAP5和BrPAP2的原始(ori)ORF均為744bp，5'UTR均為86bp，3'UTR分

5、別為175和168bp。
　　 這是在蕓薹屬植物中首次克隆全長(zhǎng)PAP基因，為深入研究蕓薹屬和十字花科植物pAP基因的功能、進(jìn)化、調(diào)控模式奠定了基礎(chǔ)，也為通過對(duì)PAP基因的轉(zhuǎn)基因操作(反義、RNA干擾、CRES-T)修飾花青素苷和種皮色素等性狀奠定了基礎(chǔ)。
　　 2)甘藍(lán)型油菜及其親本物種PAP家族的蛋白結(jié)構(gòu)特征
　　 為了進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生和比較基因組研究，這里將BnPAP5和BrPAP2的原始ORF翻譯的蛋白(BnP

6、AP5ori和BrPAP2ori)也進(jìn)行了分析。
　　 除BnPAP5和BrPAP2外，甘藍(lán)型油菜及其親本物種PAP基因家族成員的標(biāo)準(zhǔn)mRNA均編碼一個(gè)由247～250個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，分子量(Mw)為27.73～28.53kDa，等電點(diǎn)(pI)為8.73～9.01，均以亮氨酸含量最高，且堿性氨基酸殘基多于酸性氨基酸殘基。BnPAP5和BrPAP2均只有5個(gè)氨基酸殘基。
　　 預(yù)測(cè)蕓薹屬12個(gè)PAP蛋白(含BnPA

7、P5ori和BrPAP2ori，下同)均存在9～17個(gè)磷酸化位點(diǎn)，磷酸化作用可能與它們蛋白活性有關(guān)。它們均沒有信號(hào)肽，也沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)可能定位于細(xì)胞核。它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似，均是以隨機(jī)卷曲所占比例最高(47.97％～53.41％)，其次是α-螺旋(31.71％～41.30％)。在它們的N-端至近中部，均存在2個(gè)SANT/MYB-DNA-binding結(jié)構(gòu)域，且每個(gè)蛋白在R2-和R3-MYB結(jié)構(gòu)域各存在3個(gè)α-螺旋。EsyPred

8、3D預(yù)測(cè)的它們的R2R3-MYB域的三級(jí)結(jié)構(gòu)符合典型的R2R3-MYB結(jié)構(gòu)域的特征。
　　 核苷酸序列和氨基酸序列的BLAST分析、序列兩兩比對(duì)和多重比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)生分析均表明，甘藍(lán)型油菜及其親本物種PAP家族12個(gè)成員與擬南芥AtPAP基因家族有最高的相似性，預(yù)示它們和AtPAP家族一樣，編碼定位于細(xì)胞核的R2R3-MYB蛋白并調(diào)控花青素苷合成。
　　 3)來自PAP位點(diǎn)的證據(jù)表明白菜型油菜和甘藍(lán)是甘藍(lán)型油菜的基因供體核

9、酸水平和氨基酸水平的序列比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)生聚類、內(nèi)含子的一致性、特征性變異堿基、特征性變異氨基酸等方面都表明，BnPAP1來自于BrPAP1，BnPAP4來自于BoPAP1，BnPAP2來自于BoPAP2，BnPAP5來自于BrPAP2，BnPAP3來自于BrPAP3，BnPAP6來自于BoPAP3。不僅甘藍(lán)型油菜的每個(gè)PAP基因均能在親本物種中找到相對(duì)應(yīng)的供體PAP基因，而且基因數(shù)量上剛好就是2個(gè)親本物種PAP基因數(shù)量的總和。這說明，至少

10、在PAP位點(diǎn)上，白菜型油菜和甘藍(lán)是甘藍(lán)型油菜的基因供體。
　　 本研究從編碼調(diào)控關(guān)鍵酶的PAP轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員的全長(zhǎng)序列比較克隆的角度，為揭示甘藍(lán)型油菜與其親本物種間的進(jìn)化關(guān)系提供了直觀而具體的分子證據(jù)。
　　 4)在PAP位點(diǎn)上，擬南芥比蕓薹屬基本種發(fā)生了更多的加倍
　　 無(wú)論是擬南芥PAP基因家族成員(AtPAP1、AtPAP2、AtMYB113、AtMYB114)相互之間的同源性，還是蕓薹屬PAP基因家

11、族12個(gè)成員間的同源性，均明顯高于擬南芥與蕓薹屬間的PAP基因的同源性。這說明擬南芥屬和蕓薹屬中的PAP多基因現(xiàn)象，均是在它們分開后才由1條十字花科祖先PAP基因通過加倍而產(chǎn)生的，在蕓薹屬中由于“三倍化”而成了3條，而在擬南芥中則發(fā)生了“四倍化”而成了4條。
　　 C-值、分子標(biāo)記共線性和許多位點(diǎn)的對(duì)比克隆等研究均表明，在進(jìn)化中擬南芥屬表現(xiàn)出明顯的基因組收縮，而蕓薹屬則表現(xiàn)為基因組擴(kuò)張。但本研究表明，擬南芥屬與蕓薹屬分開以后，在

12、PAP位點(diǎn)上不但沒有丟失和收縮，基因加倍次數(shù)反而比蕓薹屬還多。發(fā)生這種反常的對(duì)應(yīng)關(guān)系，原因可能是在擬南芥中花青素苷性狀象在蕓薹屬中一樣也非常重要，性狀的進(jìn)化促使PAP基因加倍，或者擬南芥在進(jìn)化中PAP位點(diǎn)由于在染色體中的位置較特殊，容易發(fā)生基因的加倍。
　　 5)PAP基因的相對(duì)保守性和快速進(jìn)化特征
　　 來自于甘藍(lán)型油菜及其2個(gè)親本物種的12個(gè)PAP基因之間的一致率，在基因組水平上為59.8％～99.3％，在mRNA水

13、平上為85.2％～100％，全蛋白水平的一致率和相似率分別為77.7％～100％和82.3％～100％，R2R3-MYB結(jié)構(gòu)域的一致率和相似率分別為91.8％～100％和94.8％～100％，C-端域的一致率和相似率分別為67.9％～100％和73.6％～100％。
　　 蕓薹屬PAP基因家族與擬南芥PAP家族的間，基因組序列的一致率為59.5％～67.1％，ORF的一致率為77.8％～83.6％，全蛋白的一致率和相似率分別為6

14、5.9％～77.6％和71.9％～83.7％，R2R3-MYB結(jié)構(gòu)域的一致率和相似率分別為88.7％～96.9％和91.8％～97.9％，C-端域的一致率和相似率分別為47.9％～65.0％和55.7％～74.1％。PAP蛋白在R2R3-MYB結(jié)構(gòu)域存在很高的保守性，而C-端部分的保守性很差。因此，無(wú)論垂直同源基因間，還是水平同源基因間，PAP蛋白的C-端部分比N-端部分的歧化更快。
　　 6)揭示了PAP基因的一些新的結(jié)構(gòu)特征

15、
　　 在BnPAP2和BoPAP2中都發(fā)現(xiàn)存在可變剪切方式，除常規(guī)的剪切方式以外，二者都有在第二個(gè)內(nèi)含子結(jié)尾處多剪21bp(7個(gè)氨基酸)的可變剪切方式，導(dǎo)致所編碼蛋白在R3-MYB域的第2個(gè)α-螺旋處缺失了7個(gè)氨基酸殘基，理論預(yù)測(cè)可能會(huì)對(duì)蛋白的DNA結(jié)合能力產(chǎn)生影響，但影響的程度究竟有多大，則需要進(jìn)行功能驗(yàn)證。
　　 PAP基因家族很多成員都在5'UTR或3'UTR存在可變的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)或可變的poly(A)加尾位點(diǎn)，