甘藍(lán)型油菜全基因組SCAR標(biāo)記開(kāi)發(fā)及其應(yīng)用.pdf

1、油菜是我國(guó)主要種植的油料作物之一，隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，育種家選育出很多優(yōu)良品種，但是目前還沒(méi)有一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法對(duì)油菜新品種進(jìn)行鑒定和管理。相比傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)及生化鑒定方法，DNA指紋圖譜因其高效性和高的準(zhǔn)確性在其它作物如玉米等上得到了廣泛的應(yīng)用。此外，在水稻，玉米、油菜等品種的遺傳改良過(guò)程中，雜種優(yōu)勢(shì)的充分利用被證明是非常高效的手段之一，深入理解雜種優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生的機(jī)理將會(huì)進(jìn)一步使育種目標(biāo)的具體化和詳細(xì)化。在本研究中，所得主要

2、結(jié)果包括如下幾個(gè)方面：
　　 ⑴甘藍(lán)型油菜品種全基因組SCAR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及體系優(yōu)化。從白菜數(shù)據(jù)庫(kù)中共選取了96條CDS序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，包括開(kāi)花基因50個(gè)、抗逆基因38個(gè)、激素反應(yīng)基因8個(gè)，共設(shè)計(jì)了149對(duì)引物。根據(jù)白菜引物篩選結(jié)果，進(jìn)行Regular Blast挑選甘藍(lán)序列，選取基因序列43條，共設(shè)計(jì)了138對(duì)引物。合成的引物用于擴(kuò)增8份核心甘藍(lán)型材料的DNA，經(jīng)過(guò)三次生物學(xué)重復(fù)驗(yàn)證，最后獲得了67對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、結(jié)果穩(wěn)定的S

3、CAR標(biāo)記。通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)條件的逐步優(yōu)化，建立了甘藍(lán)型油菜全基因組SCAR標(biāo)記分析的最佳反應(yīng)體系。
　　 ⑵SCAR分子標(biāo)記用于DNA指紋圖譜構(gòu)建的可行性和有效性分析。利用本研究中所篩選得到的67對(duì)SCAR標(biāo)記，對(duì)參加2010-2011年度的區(qū)域比較試驗(yàn)的172個(gè)品系分別進(jìn)行了DNA指紋圖譜分析。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果對(duì)材料進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，用本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)的SCAR標(biāo)記能有效區(qū)分不同品種的材料。但是，2010-2011年國(guó)家冬油菜區(qū)

4、域試驗(yàn)設(shè)計(jì)的同一品種不同編號(hào)的四組內(nèi)參對(duì)照材料(編號(hào)93和128;編號(hào)114和170;編號(hào)40和143;編號(hào)108和172)中的的兩組沒(méi)有完全聚在一起，因此，我們還探索了在SCAR-PCR反應(yīng)體系中加入陽(yáng)性對(duì)照增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性研究。
　　 ⑶生物節(jié)律及種子大小基因的同源克隆與功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。根據(jù)擬南芥中已報(bào)道的產(chǎn)量性狀相關(guān)基因，挑選了與擬南芥生物節(jié)律相關(guān)的基因14個(gè)，胚發(fā)育時(shí)期物質(zhì)積累的基因19個(gè)，共設(shè)計(jì)了63條同源克隆引物。

5、PCR擴(kuò)增克隆了生物節(jié)律相關(guān)基因:GWD3，SEX4, PORB, POPA，PHS1等，胚發(fā)育時(shí)期物質(zhì)積累基因:BnWRI1，BnLEC1，BnCYp78A，BnUP2，BnNAPIN，BnBBM1，BnFAD1，BnWOX9, BnCP1，BnWOX2等。以4份不同甘藍(lán)型油菜品種的基因組DNA為模板進(jìn)行目的序列的克隆。將所得PCR產(chǎn)物連接到T載體上進(jìn)行克隆測(cè)序分析后，根據(jù)不同品種間所存在的差異位點(diǎn)信息成功開(kāi)發(fā)了特異標(biāo)記9對(duì)。但是，由

6、于這些基因在甘藍(lán)型油菜中的功能尚不清楚以及多倍體物種基因組結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，因此本研究所開(kāi)發(fā)的功能標(biāo)記是否與產(chǎn)量性狀相關(guān)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 ⑷DH(Double Haploid)群體的構(gòu)建及性狀初步分析。本實(shí)驗(yàn)以兩個(gè)不同的油菜雜交F1為小孢子培養(yǎng)材料，分別得到340、145個(gè)胚再生株系。小孢子單倍體植株通過(guò)秋水仙素處理分別使55.29％和71.03％的株系成功加倍為雙單倍體。對(duì)再生的兩個(gè)DH群體的各個(gè)單株進(jìn)行了初步的開(kāi)花期調(diào)查和