辣椒全基因組SSR和SNP標記開發(fā)及應(yīng)用.pdf

1、辣椒（Capsicum spp.）是一種世界范圍內(nèi)的重要經(jīng)濟作物。如何高效選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)辣椒品種一直以來備受辣椒育種工作者關(guān)注。建立以DNA標記技術(shù)為基礎(chǔ)的分子設(shè)計育種體系是提高辣椒選育種效率和水平的重要手段之一。近年來，辣椒基因組學研究取得的重要進展，特別是‘Zunla-1’和‘CM334’全基因組草圖的公布，為辣椒全基因組水平的分子標記開發(fā)及其在遺傳育種中的應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。本研究首先以‘Zunla-1’基因組序列為基礎(chǔ)，分析了辣

2、椒全基因組范圍的特異SSR引物；然后利用21份辣椒材料對隨機選擇的160對SSR引物進行了可用性評價。同時，利用重測序數(shù)據(jù)，分析了辣椒全基因組范圍的SNP位點?；谔暨x的15,000個SNP位點，成功合成了一張高通量Infinium SNP分型芯片。利用這張芯片分別對辣椒一個種內(nèi)F2群體（n=317株）、一個種間F2群體（n=297株）和一個由399個自交系組成的自然群體進行了基因分型?；诜N內(nèi)F2群體分型結(jié)果，對辣椒細胞質(zhì)雄性不育恢復

3、基因（CaRf）進行了精細定位研究。基于種間F2群體分型結(jié)果，對辣椒果實朝向基因（up）進行了連鎖定位研究。獲得的主要研究結(jié)果如下：
　?。?）在辣椒基因組（‘Zunla-1’）中，總共鑒定出876,580個SSR基序，平均分布密度為260.58個/Mb。根據(jù)基序之間的距離，將所有基序劃分為739,723個SSR單元。針對SSR單元進行長度過濾、引物設(shè)計和引物序列比對，最終獲得了113,500個SSR單元的特異引物序列。在隨機抽取

4、的160對引物中，有88對引物特異擴增成功。其中，65對引物表現(xiàn)出多態(tài)性，占所有測試引物的40.63％，這些多態(tài)性SSR引物在21份辣椒材料中檢測到的等位基因數(shù)目為2-6個，多態(tài)性信息量（PIC）為0.05-0.64。同時發(fā)現(xiàn)，基于65對多態(tài)性SSR引物的21份辣椒材料的聚類分析結(jié)果與形態(tài)學分類相一致。
　?。?）通過比較發(fā)現(xiàn)，在辣椒材料‘BA3’和‘B702’之間一共存在4,762,278個SNP。基于從中精選的15,000個S

5、NP位點，成功合成了一張包含12,720個SNP位點的辣椒高通量Infinium基因分型芯片（命名為CapSNP15K）。通過統(tǒng)計1,019個辣椒DNA樣本的分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CapSNP15K芯片上的8,199個位點能產(chǎn)生正常的分型信號，約占芯片位點總數(shù)的64.46%。這些位點共錨定了5,107條scaffold，覆蓋的物理總長度為2,719,081,414 bp，約占辣椒（‘Zunla-1’）基因組 de novo組裝總長度（3,349

6、,397,670bp）的81.18%。同時發(fā)現(xiàn)，CapSNP15K芯片位點重現(xiàn)率（Duplicate reproducibility）為100%，親本-親本-子代遺傳率（Parent-Parent-Child heritability）也達到了93%以上。
　?。?）在辣椒種內(nèi)‘BA3’（C.annuum）בB702’（C.annuum）F2群體的317個單株中，共有7,932個SNP位點能產(chǎn)生正常的分型信號，占CapSNP15

7、K芯片位點總數(shù)的62.36%。通過遺傳作圖，構(gòu)建了一張包含7,566個SNP標記的種內(nèi)高密度遺傳圖譜（命名為BB-SNP）。這些標記共形成1,944個遺傳bin，橫跨的遺傳總距離為1,792.60 cM，bin間的平均遺傳間距為0.95 cM。在缺失率小于10%的7,266個SNP標記中，共有383個標記（約占5.27%）發(fā)生了偏分離（P＜0.01）。
　　（4）在辣椒種間‘BA3’（C.annuum）בYNXML’（C.fru

8、tescens）F2群體的297個單株中，共有5,828個SNP位點能產(chǎn)生正常的分型信號，占CapSNP15K芯片位點總數(shù)的45.82%。通過遺傳作圖，構(gòu)建了一張包含5,569個SNP標記的種間高密度遺傳圖譜（命名為BY-SNP）。這些標記共形成3,826個遺傳bin，橫跨的遺傳總距離為1628.83 cM，bin間的平均遺傳間距為0.45 cM。在缺失率小于10%的4,879個SNP標記中，共有1,672個標記（約占34.27%）發(fā)生

9、了偏分離（P＜0.01）。
　?。?）在399份辣椒自交系中，共有8,003個SNP位點能產(chǎn)生正常的分型信號，占CapSNP15K芯片位點總數(shù)的62.92%?；谶^濾后的5,149個SNP標記的遺傳多樣性分析表明，399份辣椒自交系的平均基因多樣性、雜合性和多態(tài)性信息量（PIC）分別為0.36、0.17和0.29。親緣關(guān)系聚類分析結(jié)果顯示，除‘YNXML’和‘Y126’之外，其他397份辣椒自交系可以分為I和II兩組，它們分別包含

10、101份和296份自交系?；诰鶆蛱暨x的833個SNP標記的群體結(jié)構(gòu)分析表明，398份C.annuum自交系很可能存在P1和P2兩個群體分層，它們分別包含99份和300份材料。
　?。?）經(jīng)過育性鑒定發(fā)現(xiàn)，‘BA3’בB702’F1植株全部可育。同時，在確定育性的167個F2單株中，可育和不育的株數(shù)分別133和34，符合3：1比例（?2=1.92,P=0.17）。表明本研究所用恢復系‘B702’對CMS系‘BA3’的育性恢復作用

11、符合單基因顯性遺傳模型。基于上述F2群體單株的SNP分型和育性鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辣椒P6染色體末端的scaffold874.993498標記與辣椒細胞質(zhì)雄性不育恢復基因（CaRf）共分離。進一步通過候選區(qū)間標記加密將CaRf定位于P6染色體CIDHjm40和CIDHjm10標記之間，該區(qū)間物理總長度約為1149.66 kb。以從‘BA3’בB702’F2大群體（n=2,520株）和F2:3群體（n=1,450株）中篩選獲得的總共20個重組

12、體為材料，通過候選區(qū)域標記基因分型，最終將CaRf精細定位于CSSHjm2_16和EXON_11標記之間（P6：215.11-215.68Mb），該區(qū)間的物理總長度約為570.48 kb。
　　（7）經(jīng)過果實朝向表型鑒定發(fā)現(xiàn)，‘BA3’בYNXML’F1植株的果實朝向均表現(xiàn)側(cè)生朝下（LP）的中間類型。同時，通過統(tǒng)計 F2群體的朝向分離結(jié)果，表明本研究所用辣椒材料的果實朝向符合單基因遺傳模型，且直立朝上為隱性，朝下為顯性或不完全顯