泥蚶SSR、SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)及在群體遺傳變異分析中的應(yīng)用.pdf

1、泥蚶(Tegillarca granosa)，俗稱血蚶、花蚶、粒蚶，為我國(guó)四大海水養(yǎng)殖貝類之一。泥蚶肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、市場(chǎng)前景廣闊。本文利用泥蚶454轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)(SRA052081)，分別開(kāi)發(fā)了139個(gè)EST-SSR位點(diǎn)和78個(gè)EST-SNP位點(diǎn)，并利用多態(tài)SSR位點(diǎn)對(duì)泥蚶四個(gè)地理群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析。本研究為泥蚶的種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建以及種群鑒定提供有力工具。
　　1、泥蚶多態(tài)性EST-SSR標(biāo)

2、記的批量開(kāi)發(fā)及重疊群和單拷貝序列序列開(kāi)發(fā)SSR的差異分析
　　轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)分為重疊群（contig）序列與單拷貝（singleton）序列，利用SSRHunter軟件搜索這兩種序列中2-6核酸重復(fù)序列且長(zhǎng)度不小于12bp。singleton序列中檢出132個(gè)SSR位點(diǎn)41對(duì)引物獲得穩(wěn)定清晰的條帶，24對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)為多態(tài)性。在contig序列中篩選到246個(gè)候選位點(diǎn)，其中獲得穩(wěn)定擴(kuò)增產(chǎn)物的有157個(gè)，其中115個(gè)表現(xiàn)為多態(tài)性。

3、
　　來(lái)源于singleton序列的24個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)在泥蚶30個(gè)體中共獲得84個(gè)等位基因，多態(tài)位點(diǎn)等位基因數(shù)介于2-5個(gè)，平均等位基因數(shù)為3.5個(gè)，PIC值介于0.043-0.696之間，平均值為0.391，觀測(cè)雜合度、期望雜合度分別為0.000-0.591、0.045-0.727。24個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中有11個(gè)高度多態(tài)位點(diǎn)（PIC＞0.5）、4個(gè)中度多態(tài)位點(diǎn)（0.25＜PIC＜0.5）、9個(gè)低度多態(tài)位點(diǎn)（PIC＜0.25）。各多態(tài)位點(diǎn)

4、經(jīng)哈迪-溫伯格平衡檢測(cè)，并用Bonferroni correction法進(jìn)行校正，除Tg10、Tg11、Tg12、Tg17、Tg18、Tg21、Tg24之外，其余位點(diǎn)均顯著偏離 Hardy-Weinberg平衡（P＜0.05）。同時(shí)來(lái)源于contig序列的115個(gè)多態(tài)位點(diǎn)共獲得434個(gè)等位基因，多態(tài)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為2-10個(gè)，平均等位基因數(shù)為3.78。觀測(cè)雜合度、期望雜合度與PIC值范圍分別介于0.000-1.000、0.040-0.

5、799和0.038 to0.825。其中29個(gè)位點(diǎn)為高度多態(tài)，42個(gè)為中度多態(tài)。38個(gè)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。
　　2、基于轉(zhuǎn)錄組的78個(gè)泥蚶多態(tài)性EST-SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)
　　泥蚶EST序列拼接后獲得23320個(gè)contig序列，利用QualitySNP software對(duì)contig序列進(jìn)行SNP位點(diǎn)篩選，共獲得19329個(gè)EST-SNP候選位點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)換類型有12401，顛換類型6928。依據(jù)引物

6、設(shè)計(jì)原則，隨機(jī)選取了275個(gè)候選SNP位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。其中147對(duì)引物在泥蚶中獲得穩(wěn)定擴(kuò)增條帶，在泥蚶群體驗(yàn)證分型中101對(duì)引物獲得準(zhǔn)確分型，78個(gè)位點(diǎn)為多態(tài)性位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換類型為54個(gè)，即A-G和T-C分別占23個(gè)、31個(gè)；顛換類型為24個(gè)即A-C、A-T、G-C和G-T分別占13、4、2和5個(gè)。觀測(cè)雜合度為0.0000-0.9000，平均值為0.2982；期望雜合度為0.1997-0.5088，平均值為0.4411；最小等位基因?yàn)?.

7、0167與0.5000之間。32個(gè)位點(diǎn)極顯著偏離哈迪-溫伯格平衡，11個(gè)位點(diǎn)為顯著偏離平衡。
　　3、東南沿海4個(gè)地理泥蚶群體的遺傳變異分析
　　共采用9個(gè)雜合度較高的SSR位點(diǎn)對(duì)四個(gè)不同地理的泥蚶進(jìn)行群體分析。9對(duì)引物在4個(gè)群體的160個(gè)體中共得到了76個(gè)等位基因，平均等位基因數(shù)為8.44。每個(gè)位點(diǎn)得到的等位基因數(shù)介于3到12個(gè)。江蘇與浙江群體的遺傳分化程度微弱，廣東與福建也分化微弱。其中分化程度最高的為浙江與福建，其Fs