致病疫霉基因組微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用.pdf

1、由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一。致病疫霉微衛(wèi)星標(biāo)記可以作為研究致病疫霉生物遺傳學(xué)、群體動態(tài)演替和多樣性的分子標(biāo)記。2010年致病疫霉基因組被破譯，為研究微衛(wèi)星位點(diǎn)在基因組中的分布規(guī)律以及微衛(wèi)星標(biāo)記的批量開發(fā)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本研究在分析致病疫霉基因組微衛(wèi)星序列的基礎(chǔ)上，研究和開發(fā)致病疫霉微衛(wèi)星分子標(biāo)記，旨在為致病疫霉群體遺傳結(jié)構(gòu)研究提供參考。主要研究結(jié)果如下:

2、
　　 1.利用微衛(wèi)星序列分析軟件SciRoKo3.3確定致病疫霉基因組及其不同區(qū)域完美型和復(fù)合型微衛(wèi)星的數(shù)量，并分析其分布規(guī)律。分析發(fā)現(xiàn)，在致病疫霉基因組中共有5010個完美型微衛(wèi)星位點(diǎn)，出現(xiàn)頻率平均為26.35個/Mb，最偏好基元類型為ACGG、AT和AAG。外顯子區(qū)域微衛(wèi)星基元長度為3～6 bp的微衛(wèi)星，其中基元長度為3和6bp的微衛(wèi)星占93.68％。復(fù)合型微衛(wèi)星位點(diǎn)有275個，其中，82.18％為中斷完美類型。
　

3、　 2.根據(jù)微衛(wèi)星序列特點(diǎn)及標(biāo)記原理，推測理論適合微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)的位點(diǎn)應(yīng)該滿足單拷貝、高多態(tài)性和單一變量3個條件。因此，利用軟件SciRoKo3.3、ClustalX1.81及GenBank中Primer-BLAST引物特異性檢測程序，確定了致病疫霉基因組內(nèi)共有430個適合開發(fā)高多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)。其中，基因區(qū)比基因間區(qū)的完美微衛(wèi)星比例高、單拷貝頻率高，更適合于微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)。
　　 3.選取序列長度(L)≥25 bp

4、的適合高多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)的位點(diǎn)，在這些位點(diǎn)的兩端序列上設(shè)計專一性PCR擴(kuò)增引物，選擇9株致病疫霉菌對引物的專一性和微衛(wèi)星的多態(tài)性進(jìn)行檢測。共獲得了115個適合微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)的位點(diǎn)，經(jīng)可行性驗(yàn)證確定了64個微衛(wèi)星標(biāo)記，包含有多態(tài)性的33個，占51.56％，無多態(tài)性的31個。將具多態(tài)性的33個微衛(wèi)星標(biāo)記利用UPGMA聚類方法進(jìn)行聚類分析。通過對40株致病疫霉的區(qū)分情況分析，發(fā)現(xiàn)與所有具多態(tài)性標(biāo)記區(qū)分度相同的最小標(biāo)記數(shù)量為9。
　　

5、 4.利用40株采自不同年份和地區(qū)的致病疫霉菌株對可行性微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行等位基因數(shù)的確定及其多態(tài)性評估。發(fā)現(xiàn)具有多態(tài)性標(biāo)記的微衛(wèi)星PIC值都在0.164～0.614之間，其中PIC≥0.5的標(biāo)記有7個，分別為E-04958、I-00408、F5-22735、I-10840、I-06861、I-01408和I-07111;0.25＜PIC＜0.5的標(biāo)記有25個;PIC≤0.25的有1個。
　　 5.利用已篩選的9個致病疫霉微衛(wèi)星標(biāo)