海蜇微衛(wèi)星標記的開發(fā)及應用.pdf

1、海蜇（Rhopilema esculenta Kishinouye1891）隸屬于腔腸動物門、缽水母綱、海蜇屬，是目前國際公認的品質(zhì)最好、經(jīng)濟價值最高的可食用大型水母。海蜇營養(yǎng)結構獨特，藥用功效顯著，深受國內(nèi)外廣大消費者親睞。近年來作為大宗出口海產(chǎn)品，海蜇在我國出口創(chuàng)匯中也占有重要地位。作為傳統(tǒng)捕撈對象，我國海蜇漁業(yè)歷史悠久，20世紀七十年代，全國海蜇鮮品年捕撈量最高超過70萬噸。然而，由于長期的過度捕撈和海洋環(huán)境惡化，近二十年來，海蜇

2、自然資源急劇減少，面臨枯竭的危險。據(jù)統(tǒng)計，到八十年代后期，全國海蜇漁業(yè)捕撈量已急劇降至10萬噸左右，到2011年，全國海蜇總產(chǎn)量甚至不足1萬噸，海蜇漁業(yè)的行業(yè)價值正逐漸喪失。引起海蜇資源枯竭的原因是多方面的，從DNA分子水平上了解海蜇種群的遺傳變異水平，明確目前海蜇種質(zhì)資源的狀況，將為海蜇的種質(zhì)資源保護、標記輔助育種、人工增養(yǎng)殖方案的制定以及遺傳選育提供科學依據(jù)。
　　本論文包括以下研究內(nèi)容：
　　（1）海蜇基因組微衛(wèi)星分子

3、標記的開發(fā)與群體分析：采用“磁珠富集法”，從海蜇基因組內(nèi)篩選、設計并合成了52對引物，經(jīng)海蜇群體（N=48）驗證，篩選出15個具有遺傳多態(tài)性的微衛(wèi)星標記。15個位點共獲得93個等位基因，范圍在2-12之間，平均每個位點有6.2個等位基因。期望雜合度范圍在0.0086-0.7055之間，平均值為0.3137；表觀雜合度范圍在0.0417-0.8750之間，平均值為0.3459；15個位點中有1對偏離了哈迪溫伯格平衡定律（p<0.0033）

4、。此外，連鎖不平衡測試未發(fā)現(xiàn)位點間存在連鎖不平衡。
　?。?）海蜇轉錄組微衛(wèi)星分子標記的開發(fā)與群體分析：從海蜇轉錄組文庫中共挑選出83對引物，經(jīng)海蜇群體（N=48）驗證，最終開發(fā)出17個具有遺傳多態(tài)性的微衛(wèi)星標記。獲得69個等位基因，范圍在2-11之間，其中有15個位點等位基因數(shù)在2-6之間。期望雜合度范圍在0.1180-0.5353之間，平均值為0.3568；表觀雜合度范圍在0.0417-0.5833之間，平均值為0.3346。

5、通過計算平衡時P值，Bonferroni校正后發(fā)現(xiàn)其中有1個位點偏離了哈迪溫伯格平衡定律（p<0.0029）。經(jīng)過連鎖不平衡檢測實驗結果，發(fā)現(xiàn)有3對位點間有連鎖不平衡。
　?。?）海蜇轉錄組微衛(wèi)星分子標記的應用：
　　a）海蜇轉錄組微衛(wèi)星分子標記跨屬的可轉移性應用：從海蜇轉錄組文庫里挑選出127對序列引物，合成后在沙海蜇群體（N=48）中進行擴增。結果共開發(fā)出14個多態(tài)性位點，獲得42個等位基因，范圍在2-4之間，期望雜合度

6、范圍是0.1333-0.7055，平均值為0.3574；表觀雜合度范圍是0.2979-0.7292，平均值為0.5919；有2個偏離了哈迪溫伯格平衡定律（P＜0.0036），有2對（RE5-RE11和RE5-RE49）位點間存在連鎖不平衡。
　　b）海蜇轉錄組微衛(wèi)星分子標記跨目的可轉移性應用：從海蜇轉錄組文庫里挑選出127對序列引物，合成后在海月水母群體（N=48）中進行擴增。結果共開發(fā)出35個多態(tài)性位點。包括4種重復類型，其中二

7、核苷酸有10個，以(AT)n居多；三核苷酸有23個，以(CTT)n和(GTT)n最多；四核苷酸重復、復合核苷酸重復各為一個。擴增產(chǎn)物大小在139-279bp之間，退火溫度在48℃-62℃之間。
　　C）海蜇轉錄組微衛(wèi)星分子標記在沙海蜇不同地理群中的應用：將a）中自主開發(fā)的14個多態(tài)性位點，應用到山東半島和長江口海域的兩個沙海蜇野生群體中，結果表明位點均具有較好的多態(tài)性。平均觀測等位基因數(shù)是4.21，平均有效等位基因數(shù)是2.03。觀

8、測雜合度范圍平均值為0.2415；無偏期望雜合度平均值為0.8404。近交系數(shù) Fis平均值為0.2276?；蚍只禂?shù)（Fst）值表明，兩個位點屬于高度遺傳分化；兩個位點屬于中度分化；其余10個位點屬于輕度遺傳分化?；蚍只禂?shù)平均值為0.1060，表明種群間遺傳變異占總遺傳變異的比例有10.60％。群體間遺傳相似性系數(shù)（I）為0.8308，遺傳距離（D）為0.1147。表明兩個沙海蜇地理群間遺傳差異程度很低，遺傳相似度極高。

9、　　d）采用轉錄組454 GS FLX測序和PCR技術，以海蜇和沙蜇的基因組DNA為模板，分別克隆了包含EST-SSR和EST-SNP標記的β-連環(huán)蛋白基因目的片段。生物信息學分析顯示，β-連環(huán)蛋白基因目的片段長度分別為166/169 bp和157/160 bp，均沒有內(nèi)含子。海蜇β-連環(huán)蛋白基因目的片段除了微衛(wèi)星重復差異外，只有一個堿基的差異；沙海蜇除了微衛(wèi)星重復差異外，其余完全一致。在海蜇和沙海蜇β-連環(huán)蛋白基因目的片段的相同位置均