櫛孔扇貝（Chlamys farreri）微衛(wèi)星標記的篩選及應(yīng)用.pdf

1、櫛孔扇貝(Chlamys.farteri)是我國傳統(tǒng)的經(jīng)濟養(yǎng)殖貝類，近年來在扇貝種苗繁育及養(yǎng)成過程中出現(xiàn)的問題提示了實現(xiàn)櫛孔扇貝的良種化，選育抗病、抗逆和生長迅速的新品種是櫛孔扇貝養(yǎng)殖業(yè)健康與可持續(xù)性發(fā)展的有效途徑。而飛速發(fā)展的分子標記輔助育種體系為優(yōu)良品種的快速培育提供了理論基礎(chǔ)和實踐經(jīng)驗。隨著分子標記輔助育種體系的不斷發(fā)展和完善，也出現(xiàn)眾多亟待解決的問題，如基礎(chǔ)群體的構(gòu)建、選育群體遺傳多樣性的維系和重要經(jīng)濟性狀的遺傳學(xué)解析等。本研究

2、以櫛孔扇貝為主要研究材料，探討了扇貝微衛(wèi)星標記的篩選和評價及微衛(wèi)星標記在扇貝標記輔助育種中的應(yīng)用。 1.櫛孔扇貝微衛(wèi)星標記的篩選和評價 本研究利用PCR掃描法、菌落原位雜交法、構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫法、快速篩選AFLP片段中的微衛(wèi)星DNA(FIASCO)和EST文庫篩查法5種方法發(fā)展了櫛孔扇貝315個微衛(wèi)星標記。利用至少48個櫛孔扇貝個體對其中289個位點進行多態(tài)性評價，結(jié)果顯示擴增得到的等位基因數(shù)目從2到30個不等，期望雜

3、合度和觀測雜合度的范圍分別為0.0791～0.9878和0.0000～1.0000。通過比較這5種方法發(fā)現(xiàn)：EST文庫篩查法是最簡便、耗費最低的方法，但是公用數(shù)據(jù)庫中櫛孔扇貝較少的EST序列(3467個)和較低含量(1.9％)的微衛(wèi)星DNA限制了此種方式的應(yīng)用。而本章優(yōu)化的FIASCO法和構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫法由于自身的高效低耗等優(yōu)點成為從扇貝中大量篩選微衛(wèi)星標記的最好選擇。 2.櫛孔扇貝微衛(wèi)星連鎖圖譜的構(gòu)建及生長相關(guān)性狀QTLs

4、定位的初步研究 為了加強櫛孔扇貝選育工作的有效性和準確性，真正在櫛孔扇貝中實現(xiàn)分子標記輔助選育，本文利用2個半同胞F1代家系(共享母本，本實驗室培育的蓬萊紅新品種)和318個標記(包括315個微衛(wèi)星標記、2個小衛(wèi)星標記和1個形態(tài)學(xué)標記)成功構(gòu)建了櫛孔扇貝的遺傳連鎖圖譜。利用在不同性別中分離的標記分別構(gòu)建了櫛孔扇貝雌性和雄性連鎖圖譜，并利用軟件Joinmap整合了不同性別的連鎖圖譜。整合的圖譜共19個連鎖群，和櫛孔扇貝單倍體染色體

5、數(shù)目一致。19個連鎖群共含有154個標記，覆蓋整個櫛孔扇貝基因組的1561.8cM(約77.0％的覆蓋率)，平均標記間隔為12.3 cM。連鎖分析結(jié)果顯示，雄性個體之間以及雄性個體和雌性個體之間重組率存在顯著性差異，這些差異似乎和性別沒有關(guān)系，而是和不同家系中的個體有關(guān)。但這種差異并未體現(xiàn)在整個圖譜上，而是出現(xiàn)在15個連鎖群的18個區(qū)域上。利用該圖譜進行了生長相關(guān)性狀的QTL定位。在整合的圖譜上共定位了25個關(guān)于殼長、殼寬、殼高和總重相

6、關(guān)的QTL。其中檢測得到的殼長、殼寬、殼高和總重相關(guān)的QTL的數(shù)目分別為7、6、6和6個。這些QTL成簇的分布于9個連鎖群上，單個QTL，可以解釋表型方差的4.0％～22.2％。這些生長相關(guān)性狀的QTL定位為我們下一步從事分子標記輔助選提供了有待于進一步操作的參考連鎖區(qū)間。 3.櫛孔扇貝不同群體遺傳結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星分析 1)、一個選育方案的可持續(xù)性發(fā)展與否取決于基礎(chǔ)群的質(zhì)量和選育過程中遺傳多樣性的維系。本研究利用9個多態(tài)性微

7、衛(wèi)星標記評價了早期建立的一個選育方案中基礎(chǔ)群體和選育群體的遺傳多樣性和遺傳分化。分析結(jié)果顯示，基礎(chǔ)群體的遺傳多樣性非常豐富，在所有的9個位點上共擴增得到106個等位基因，平均每個位點擴增得到11.8個。群體的平均觀測雜合度和平均期望雜合度分別為0.6007和0.7212。所有的遺傳學(xué)分析均顯示選育5代群體發(fā)生了顯著的遺傳分化。盡管選育兩代群體在等位基因數(shù)目和雜合度上與BP群體不存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異，但是3個位點上的等位基因頻率差異和2

8、個位點上的基因型頻率差異暗示了P2群體正在經(jīng)受"瓶頸效應(yīng)"的影響；同時，最常見等位基因的變化(包括大小和頻率)也說明了P2群體發(fā)生了遺傳分化。本研究還顯示隨著選育年限(代數(shù))的增加，選育群體的遺傳多樣性丟失加劇。 2)、海洋底棲軟體生物由于自身獨特的生活史，不同的地理群體之間會有較大的遺傳分化。但是，大多數(shù)海洋雙殼類如扇貝有一段很長的浮游幼蟲期，這段浮游幼蟲期會彌補由于成體遷移困難所造成群體之間個體交換的不足。這一對矛盾使得我們

9、很難估計不同采樣地點取得的群體的遺傳分化，即使樣品是從較小尺度海域取到的。櫛孔扇貝是我國重要的經(jīng)濟性貝類，與其它雙殼類相比，櫛孔扇貝在我國的自然棲息地相對較狹。然而，像其它雙殼貝類一樣，櫛孔扇貝成體固著生活，但有一段較長的浮游幼蟲期(自然狀態(tài)下大約15天)。這些特點會導(dǎo)致櫛孔扇貝較差的地理分化。本研究利用9個多態(tài)性微衛(wèi)星標記分析了我國北方6個代表性采樣地點的6個群體的遺傳多樣性和遺傳分化。所有的群體均顯示出較高的遺傳多樣性，每個群體擴增

10、得到的等位基因數(shù)目從9.0個到14.6個不等，期望雜合度和觀測雜合度分別為0.5135-0.6604和0.6632-0.8173。所有的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示：取自渤海和黃海交界處的長島野生群體和取自黃海的煙臺群體之間沒有明顯的遺傳分化，而取自黃海的其它4個群體之間及取自黃海和取自渤海的群體之間存在明顯的遺傳分化。我們利用景觀遺傳學(xué)手段(遺傳阻隔預(yù)測和個體歸群分析)進一步分析了產(chǎn)生這些遺傳分化的主要因素，結(jié)果顯示預(yù)測的遺傳阻隔和實際的海洋渦旋吻