櫛孔扇貝(Chlamys farreri)血細(xì)胞酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的研制與應(yīng)用.pdf

1、血細(xì)胞是貝類生物細(xì)胞免疫的主要執(zhí)行者,是抵御外來病原侵襲和環(huán)境刺激的主要“屏障”。血細(xì)胞數(shù)量及胞內(nèi)酶活的變動可以作為一個用于指示扇貝受病原感染或環(huán)境脅迫的免疫指標(biāo)。本論文研究了櫛孔扇貝(Chlamys farreri)經(jīng)病毒感染和多糖刺激后血細(xì)胞數(shù)量及胞內(nèi)酶活的變化規(guī)律;分類、分離了櫛孔扇貝各種類型血細(xì)胞,以此為抗原研制出了抗各種類型血細(xì)胞的單克隆抗體:利用單抗制備了檢測扇貝血細(xì)胞的酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒;應(yīng)用試劑盒監(jiān)測了扇貝在自

2、然生長及脅迫環(huán)境下的血細(xì)胞變化;旨在為評估扇貝的健康狀況提供手段和理論依據(jù)。本論文主要包括以下5部分:
　　 1櫛孔扇貝經(jīng)病毒感染后的血細(xì)胞變化用不同濃度(50、5-1、5-2、5-3、5-4、5-5、5-6和5-7)的櫛孔扇貝急性病毒性壞死病毒(AVNV),25℃(病發(fā)溫度)人工感染扇貝,觀察感染后各濃度組的存活率,確定了5-3、5-4和5-5為較適宜的感染濃度。分別以5-3和5-5病毒濃度人工感染扇貝,感染后每天測定血細(xì)胞總

3、數(shù)(THC)、血細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)、髓過氧化物酶(MPO)和過氧化物酶(POD)的變化,共測定15天。結(jié)果顯示:感染后前8、9天,THC顯著降低,而ACP、SOD、PO、MPO顯著升高,POD無明顯規(guī)律,ALP未被檢測到;感染10天后,各免疫指標(biāo)逐漸恢復(fù)到對照值。此外,5-3濃度對各免疫指標(biāo)的影響幅度要大于5-5濃度。結(jié)果表明:血細(xì)胞在應(yīng)激病毒感染過程中起著關(guān)鍵作

4、用。
　　 2櫛孔扇貝經(jīng)β-葡聚糖刺激后的血細(xì)胞變化分別在15℃(最適溫度)和25℃對櫛孔扇貝注射0.5、1.0、2.0 mg/ml的β-葡聚糖,注射后每12小時測定THC和胞內(nèi)ACP、ALP、SOD、PO、MPO和POD的變化,共測定7天。結(jié)果顯示:15℃時,THC在0.5、1.0、2.0 mg/ml組均顯著升高;而PO在0.5、1.0、2.0 mg/ml組,ACP,SOD和POD在1.0和2.0 mg/ml組,MPO和ALP

5、分別在1.0和2.0 mg/ml組被顯著激活。25℃時,THC只在1.0 mg/ml組顯著升高:PO在0.5和1.0 mg/ml組,ACP在1.0和2.0 mh/ml組,SOD在1.0 mg/ml組被顯著激活,而POD,MPO和ALP則未被激活或未被檢測到。此外,THC、PO、ACP和SOD在25℃時的提升幅度和持續(xù)時間不及15℃。結(jié)果表明:血細(xì)胞在應(yīng)激高溫和β-葡聚糖刺激過程中起著關(guān)鍵作用;而高溫能削弱扇貝識別和結(jié)合外源刺激物的能力,

6、從而增加了被侵染的機(jī)率。
　　 3抗各種類型血細(xì)胞的單克隆抗體的研制用Pcrcoll不連續(xù)密度梯度(10、20、30、40和50％)離心法分離了櫛孔扇貝全血細(xì)胞,吉姆薩染色和流式細(xì)胞術(shù)鑒定了各層血細(xì)胞的成分,確定了30-40％界面層為透明細(xì)胞,而40-50％界面層為顆粒細(xì)胞。分別收集透明細(xì)胞和顆粒細(xì)胞免疫小鼠,細(xì)胞融合,間接免疫熒光法(IIFA)篩選,克隆,所得單抗再經(jīng)流式免疫熒光法(FCIFA)和Western blottin

7、g法(WBA)特性分析。結(jié)果顯示:共篩選克隆得到7株既抗透明細(xì)胞和又抗顆粒細(xì)胞的單抗1F7,4D5,5C6,4G11,6A6,2H11,4E2,和1株只抗顆粒細(xì)胞的單抗6H7,沒有得到只抗透明細(xì)胞的單抗。單抗1F7的陽性率為82±2.4％,其中陽性透明細(xì)胞(PH)占34±2.2％,陽性顆粒細(xì)胞(PG)占48±3.1％:它抗原決定簇豐富,能與多個血細(xì)胞蛋白結(jié)合。單抗4D5的陽性率為76±2.3％,其中PH占37±2.4％,PG占39±1.

8、1％;它能與分子量為16.7,87和96 kDa的血細(xì)胞蛋白結(jié)合。單抗5C6的陽性率為70±2.6％,其中PH占32±1.9％,PG占38±2.4％;它能與分子量為16.7 kDa的血細(xì)胞蛋白結(jié)合。單抗6H7的陽性率為62±2.5％,其中PG占54±3.0％,PH僅占8±2.3％,它能與分子量為155 kDa的血細(xì)胞蛋白結(jié)合。
　　 4扇貝血細(xì)胞酶聯(lián)免疫試劑盒的研制用IIFA,FCIFA和WBA從血細(xì)胞單抗庫中篩選單抗作為櫛孔扇

9、貝血細(xì)胞酶聯(lián)免疫試劑盒的第一抗體。梯度稀釋抗原抗體,ELISA棋盤滴定法確定抗原抗體的最佳使用稀釋度。高溫(25℃)和病毒(5-4 AVNV)刺激櫛孔扇貝,ELISA檢測各刺激條件下的血細(xì)胞變化,以常溫和高溫刺激的比較結(jié)果制定扇貝正常狀態(tài)與受環(huán)境脅迫的臨界范圍,以未感染和病毒感染的比較結(jié)果制定扇貝受環(huán)境脅迫與病原感染的臨界范圍,建立評估標(biāo)準(zhǔn)。最后組裝制備試劑盒。結(jié)果顯示:單抗1F7具陽性率高,抗透明細(xì)胞和顆粒細(xì)胞,及抗原決定簇豐富的特性

10、被確定為試劑盒的第一抗體?？乖涂贵w的最佳使用稀釋度為抗原稀釋2倍,抗體稀釋4倍。待檢樣品OD405nm值＞0.5±0.025,屬體質(zhì)正常范圍;待檢樣品OD405nm值＜0.47±0.019,屬病原感染范圍;兩者之間為環(huán)境脅迫范圍。試劑盒包括酶標(biāo)板,封閉液,單抗1F7,堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的羊抗鼠抗體,顯色液,櫛孔扇貝血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品及檢測結(jié)果評估標(biāo)準(zhǔn)等,其靈敏度可達(dá)200 ng/ml。
　　 IIFA分析了抗櫛孔扇貝顆粒細(xì)胞的

11、單抗6H7與蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)、海灣扇貝(Argopecten irradians)顆粒細(xì)胞的交叉性,確定了單抗6H7能與這兩種扇貝的顆粒細(xì)胞特異性結(jié)合,但不與透明細(xì)胞結(jié)合。將單抗6H7選作為扇貝顆粒細(xì)胞酶聯(lián)免疫試劑盒的第一抗體。分別梯度稀釋櫛孔扇貝、蝦夷扇貝、海灣扇貝抗原,梯度稀釋單抗6H7,ELISA棋盤滴定法確定抗原抗體的最佳使用稀釋度。最后組裝制備試劑盒。結(jié)果顯示:不經(jīng)稀釋的抗原抗體具最佳的

12、結(jié)合效果。試劑盒包括酶標(biāo)板,封閉液,單抗6H7,AP標(biāo)記的羊抗鼠抗體,顯色液,三種扇貝血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品等,其靈敏度可達(dá)5μg/ml。
　　 5扇貝血細(xì)胞酶聯(lián)免疫試劑盒的應(yīng)用于2009年3月至2010年1月,每月中旬從山東地區(qū)采集櫛孔扇貝,測完殼長后,取血,用試劑盒研究櫛孔扇貝血細(xì)胞變化與生長的關(guān)系。用5-4 AVNV人工感染櫛孔扇貝,感染后用試劑盒每天測定顆粒細(xì)胞的變化,共測定9天。將海灣扇貝分成兩組:一組每天實施投喂,另一組則不

13、投喂,用試劑盒每周測定兩組扇貝顆粒細(xì)胞的變化,共測定5周。結(jié)果顯示:4,5,6月櫛孔扇貝生長較快,對應(yīng)的血細(xì)胞數(shù)量較多;8,9,10月生長緩慢,對應(yīng)的血細(xì)胞數(shù)量則少。病毒感染后第1天,櫛孔扇貝顆粒細(xì)胞數(shù)顯著升高;隨后急劇下降,于第3天達(dá)到最低值;之后開始回升,于第6、7天又顯著升高;最后恢復(fù)到對照值。饑餓脅迫后,海灣扇貝顆粒細(xì)胞數(shù)前3周呈依次顯著遞減的趨勢,3周后基本不再下降;投喂組的顆粒細(xì)胞數(shù)5周內(nèi)基本維持同一水平。測定結(jié)果表明本論文