櫛孔扇貝(Chlamys farreri)DNA斷裂與海水高滲透壓關(guān)系的探究.pdf

1、關(guān)于滲透壓對細(xì)胞DNA影響的研究在陸地生物中很少,海洋生物則更少,本研究領(lǐng)域?qū)儆趪H前沿。本文在櫛孔扇貝原代培養(yǎng)血淋巴細(xì)胞的基礎(chǔ)上,采用彗星實驗和 TUNEL實驗方法,從多角度雙向驗證了海洋的高滲透壓(1200mOsm/L)會引起櫛孔扇貝DNA的斷裂,產(chǎn)生3’-OH末端。并且這種DNA斷裂是可逆的,當(dāng)外界環(huán)境的滲透壓下降到低滲透壓水平(460mOsm/L)時,DNA斷裂又會自動修復(fù)。
　　1.櫛孔扇貝血細(xì)胞的原代培養(yǎng)
　　首

2、先,實驗材料是櫛孔扇貝的原代血淋巴細(xì)胞,采用的是1200mOsm/L的改進L-15培養(yǎng)基,在20℃,pH=7.6下進行培養(yǎng),。血淋巴細(xì)胞在1~3天內(nèi)已達(dá)到大量貼壁水平,培養(yǎng)3天內(nèi),血淋巴細(xì)胞細(xì)胞存活率高于90％。培養(yǎng)至10~15天,細(xì)胞逐漸死亡。培養(yǎng)3天以內(nèi)的櫛孔扇貝原代血淋巴細(xì)胞完全達(dá)到了進行彗星實驗以及TUNEL實驗的標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.彗星實驗
　　彗星實驗中,以櫛孔扇貝原代培養(yǎng)的血細(xì)胞為細(xì)胞材料,對數(shù)期生長的H1299細(xì)

3、胞系為陰性對照,對原代血細(xì)胞培養(yǎng)物進行了32h連續(xù)監(jiān)測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),低滲透壓(460mOsm/L)細(xì)胞的Tail DNA%始終遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于高滲透壓(1200mOsm/L)中的細(xì)胞Tail DNA%,前者的Tail DNA%保持在6.04%到13.29%之間,后者的Tail DNA%自28.75%逐步升高至60.86%;交換滲透壓后,低、高滲透壓細(xì)胞的Tail DNA%情況也發(fā)生交換。因此證明:高滲透壓環(huán)境會導(dǎo)致櫛孔扇貝的血淋巴細(xì)胞DNA斷裂,

4、當(dāng)滲透壓降低時,又會誘導(dǎo)DNA斷裂的修復(fù)。另外測量了扇貝個體的活體血淋巴細(xì)胞的Tail DNA%,結(jié)果發(fā)現(xiàn),活體血細(xì)胞的Tail DNA%在不斷變化,有時斷裂程度較低,Tail DNA%約在10%以下;有時斷裂程度較高,約在25%以上。
　　3.TUNEL實驗
　　用TUNEL法對原代櫛孔扇貝血淋巴細(xì)胞進行了體外實驗,發(fā)現(xiàn):在465-495nm波長下,高滲透壓下培養(yǎng)的細(xì)胞有很強綠色熒光,DNA斷裂情況嚴(yán)重。低滲透壓下培養(yǎng)細(xì)胞