櫛孔扇貝(Chlamys farreri)幼蟲和成體組織細胞的體外培養(yǎng)體系建立和特征分析.pdf

1、探索海洋貝類細胞培養(yǎng)體系建立方法的研究是一項意義重大且負有挑戰(zhàn)的課題。一方面體外細胞培養(yǎng)體系是闡明養(yǎng)殖病原微生物致病機制、細胞分子育種、功能基因的深入研究等諸多科研領域急需的實驗工具；另一方面，目前在世界范圍內，尚未建立針對海洋貝類生物細胞培養(yǎng)的成熟方法。本研究旨在建立一種適用于海洋貝類的細胞培養(yǎng)方法，提高貝類細胞培養(yǎng)體系的研究應用能力。
　　本文以中國北方重要的經濟貝類櫛孔扇貝為實驗對象，選取多種細胞類型進行體外培養(yǎng)體系建立的研

2、究。以優(yōu)化培養(yǎng)條件的傳統(tǒng)方法為基礎，通過添加因子和外源基因導入等手段誘導細胞轉化，建立了櫛孔扇貝擔輪幼蟲和成體組織細胞體外培養(yǎng)體系；進一步對櫛孔扇貝幼蟲體外傳代培養(yǎng)細胞的特性和功能進行了初步分析。主要結果如下：
　　本文通過優(yōu)化細胞解離方法、向基礎培養(yǎng)基中添加誘導因子等，有效地促進和維持了體外培養(yǎng)櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞的增殖能力和長期存活，成功地實現了幼蟲細胞在體外傳代培養(yǎng)19代。研究發(fā)現：使用無鈣海水配以機械法獲得的解離細胞活力明

3、顯高于使用膠原酶和胰酶酶解獲得的細胞；添加適宜濃度的胎牛血清可提高細胞的有絲分裂能力和貼壁能力；添加適宜濃度的櫛孔扇貝血清可提高體外培養(yǎng)細胞的貼壁能力和維持細胞形態(tài)；添加適宜濃度的卵黃提取液可促進傳代培養(yǎng)后期細胞的增殖和貼壁能力； EGF和bFGF生長因子組合的添加可有效延長細胞壽命并維持細胞形態(tài)。擔輪幼蟲細胞體外培養(yǎng)體系中主要包括3類細胞，分別是圓形透亮細胞、圓形顆粒大細胞和圓形黑色小細胞；其中圓形透亮細胞具有最佳的生理狀態(tài)，如在Pe

4、rco ll分離后體系中，該種類細胞于12 h后即可貼壁且分裂速度較快。但整體而言，3類細胞的增殖能力和貼壁能力均隨體外培養(yǎng)時間的延長呈現逐漸減弱的趨勢。進一步，通過櫛孔扇貝ITS序列擴增鑒定所獲體外傳代培養(yǎng)物屬于櫛孔扇貝細胞。
　　使用流式細胞儀檢測了櫛孔扇貝擔輪幼蟲原代、第12代和第18代體系中S期細胞的比例，顯示隨著體外培養(yǎng)細胞傳代次數的增加，S期細胞所占的比例逐漸降低；采用原位雜交技術比較了櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養(yǎng)原代細胞

5、和傳代細胞中piwi（參與維持細胞的自我更新特征）和phb2（細胞周期中抑制G1期向S期的過度）基因的表達，結果顯示：櫛孔扇貝擔輪幼蟲原代和傳代培養(yǎng)體系中的3類細胞均可表達piwi和phb2基因；其中piwi基因在原代培養(yǎng)細胞胞質中的陽性信號較第16代細胞的致密；phb2基因在第16代細胞中的表達明顯強于原代細胞；呈現出隨培養(yǎng)代數增多細胞的增殖能力逐漸衰退。
　　采用免疫組織化學技術揭示了體外培養(yǎng)細胞肌凝蛋白（細肌絲成分），5羥色

6、胺（神經遞質成分），肌動蛋白和微管蛋白（細肌絲或細胞骨架成分）等的表達，發(fā)現櫛孔扇貝幼蟲細胞體外培養(yǎng)至16代時，細胞中肌凝蛋白的表達較原代培養(yǎng)細胞時期更加顯著，暗示該時期細胞有向肌細胞分化的趨勢，但其分化時間較正常發(fā)育的擔輪幼蟲細胞晚。本次我們未在體外培養(yǎng)的幼蟲細胞中檢測到神經遞質5羥色胺的表達，與正常發(fā)育的中后期擔輪幼蟲頭部區(qū)細胞首先檢測到兩個表達位點的結果不一致。
　　本研究采用優(yōu)化培養(yǎng)體系的方法，建立了櫛孔扇貝血淋巴、鰓、卵

7、巢、精巢、心臟等成體組織細胞的原代培養(yǎng)體系，各種組織細胞均可在體外存活2.5周以上；進一步，嘗試了脂質體（Lipo2000）、陽離子聚合物（PEI）和慢病毒介導外源基因SV40LT（猿猴病毒大T抗原基因）誘導體外原代培養(yǎng)細胞的轉化，其中慢病毒感染法對細胞傷害最小，轉染效率最高可達到25％，能夠使轉基因后的貝類體外培養(yǎng)細胞的平均存活壽命顯著延長，并在病毒感染后的心臟細胞培養(yǎng)體系中發(fā)現細胞分裂相。
　　綜上，本研究所建立的扇貝幼蟲體外