櫛孔扇貝和海灣扇貝G型溶菌酶基因及櫛孔扇貝硒結(jié)合蛋白基因的克隆和表達(dá)研究.pdf

1、海灣扇貝和櫛孔扇貝作為我國優(yōu)良的海水養(yǎng)殖品種近年來得到了很大的推廣，構(gòu)成了海洋貝類養(yǎng)殖業(yè)的主體。盡管我國的扇貝養(yǎng)殖規(guī)模在過去的幾十年中達(dá)到一定水平，養(yǎng)殖總產(chǎn)量也居國際領(lǐng)先地位，但貝類的分子免疫學(xué)及其相關(guān)的病害防治研究相對國外卻相對薄弱，近年來我國養(yǎng)殖扇貝的病害問題一直困擾著該產(chǎn)業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展。盡管針對扇貝養(yǎng)殖環(huán)境、病原以及養(yǎng)殖技術(shù)等方面開展了大量的研究工作，提出了許多防病治病措施，也取得了一定的成效。但由于引起養(yǎng)殖扇貝病害的病原和

2、發(fā)病原因的多樣性，大量使用抗菌素和農(nóng)藥后造成病原微生物抗藥性的提高以及對環(huán)境造成的嚴(yán)重破壞，所以貝類養(yǎng)殖業(yè)要擺脫病害的困擾，必須開辟新的疾病防治途徑。本研究從2個方面開展扇貝分子免疫學(xué)的工作，一是篩選和克隆了參與調(diào)控免疫防御的功能基因，根據(jù)抗病功能基因的結(jié)構(gòu)以及這些基因在個體或群體感染后或環(huán)境脅迫條件下的表達(dá)情況，深入研究扇貝的防御抗病機制，探討提高機體抗病力的方法和途徑，并作為抗病良種選育的分子標(biāo)記，指導(dǎo)扇貝的遺傳改良和抗病品系的培育

3、。二是篩選研制新型的具有抗微生物活性的多肽或蛋白基因，并對這些基因?qū)崿F(xiàn)體外大量表達(dá)，在扇貝養(yǎng)殖業(yè)上作為新型的病害預(yù)防治療制劑，取代目前普遍使用的抗菌素和化學(xué)藥物。 1.櫛孔扇貝硒結(jié)合蛋白cDNA的克隆與免疫相關(guān)性研究含硒的生物大分子在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。本研究采取大規(guī)模的EST(ExpressedSequenceTag)測序方法，結(jié)合錨定PCR技術(shù)克隆得到了1個櫛孔扇貝硒結(jié)合蛋白的全長cDNA序列。櫛孔扇貝硒結(jié)合蛋白zS

4、eBP全長1664bp，包括一個33bp的5'末端非編碼(untranslatedregion，UTR)和一個188bp的3'UTR，其開放式讀碼框(openreadingframe，ORF)長1443bp，可編碼480個氨基酸組成的zSeBP前體蛋白，預(yù)測分子量為54kDa，等電點為6.5。同源性分析表明克隆的zSeBPcDNA序列與哺乳動物、魚類、鳥類、昆蟲甚至微生物和植物的硒結(jié)合蛋白基因都具有很高的相似性。這表明從櫛孔扇貝中克隆得

5、到的cDNA序列是硒結(jié)合蛋白家族的成員比且硒結(jié)合蛋白在生物體內(nèi)具有重要的不可替代的作用。為了驗證zSeBP的免疫相關(guān)性，我們用比較免疫學(xué)的方法分別用雙氧水和三種不同類型的微生物來刺激櫛孔扇貝并用半定量RT-PCR檢測zSeBP刺激后不同時間段在血淋巴中mRNA的表達(dá)水平，同時我們?nèi)∠鄳?yīng)的全組織勻漿液檢測丙二醛(MDA)的指標(biāo)。結(jié)果表明，雙氧水或微生物刺激后zSeBP在血淋巴的mRNA表達(dá)水平可顯著加強并且它們的表達(dá)趨勢相近，這說明它們的

6、應(yīng)激機理相似，都是由于在刺激過程中氧代謝的失衡引發(fā)zSeBP的表達(dá)；同時MDA的指標(biāo)升高也說明在微生物刺激后扇貝體內(nèi)的氧代謝平衡被打破，比較不同微生物刺激后的zSeBP的表達(dá)水平和MDA的指標(biāo)，我們發(fā)現(xiàn)它們存在負(fù)相關(guān)性，說明zSeBP在扇貝防御微生物感染和維持體內(nèi)正常氧代謝的過程中發(fā)揮著重要的作用。 2.櫛孔扇貝和海灣扇貝G型溶菌酶基因cDNA的克隆與分析溶菌酶是自然界中廣泛存在的具有抗菌效應(yīng)的分子，它在無脊椎動物的免疫反應(yīng)中發(fā)

7、揮著重要的作用。通過EST和錨定PCR技術(shù)，從海灣和櫛孔扇貝中克隆得到一種溶菌酶基因的全長cDNA。海灣扇貝溶菌酶基因的cDNA全長659bp，櫛孔扇貝溶菌酶基因的cDNA全長829bp，均編碼200個氨基酸。BLASTx分析的結(jié)果顯示它們和脊椎動物g-型溶菌酶相似性較高，卻不同于無脊椎動物中己發(fā)現(xiàn)的c型和i型溶菌酶。在其編碼的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了g型溶菌酶的活性中心(Glu82，Asp97，Asp108)，同時6個保守的半胱氨酸也與鳥類

8、和魚類的g型溶菌酶相一致。結(jié)合BLAST分析的結(jié)果，可以確認(rèn)所獲得的cDNA序列是一種在無脊椎動物中首次發(fā)現(xiàn)的G型溶菌酶的編碼序列。采用Clustalw軟件，對多種脊椎動物c-型、g-型溶菌酶和無脊椎動物c-型、i-型溶菌酶以及本研究發(fā)現(xiàn)的無脊椎動物g型溶菌酶進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無脊椎動物c-型、i-型溶菌酶和脊椎動物c-型溶菌酶同源性較高，而海灣扇貝g型溶菌酶和脊椎動物g-型溶菌酶同源性較高。由此說明c-型、g-型溶菌酶從無脊椎到脊椎動