華貴櫛孔扇貝卵黃蛋白原基因克隆表達(dá)及其免疫功能的初步研究.pdf

1、華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobilis)以其貝殼具有橙色、橙紫色、紫色、褐色等多種絢麗的色彩而聞名。因其營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美、生長(zhǎng)快、養(yǎng)殖周期短、經(jīng)濟(jì)效益高，自上世紀(jì)70年代就已經(jīng)成為我國(guó)南方重要的海水養(yǎng)殖貝類。
　　卵黃蛋白原(Vitellogenin,Vg)作為卵黃蛋白(Yolkprotein,Vn)的前體，廣泛存在于卵生非哺乳類性成熟動(dòng)物中，在卵子和胚胎的發(fā)育過(guò)程中具有重要的作用，不僅能為發(fā)育中的動(dòng)物胚胎提供氨基酸、脂肪、

2、碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還能轉(zhuǎn)運(yùn)類胡蘿卜素、維生素等功能性物質(zhì)，此外，還在生物體內(nèi)參與免疫防御過(guò)程，具有免疫功能。
　　本文以華貴櫛孔扇貝橙色和褐色個(gè)體為材料，首次克隆了Vg基因的全長(zhǎng)cDNA，并進(jìn)行了同源性分析、時(shí)空表達(dá)分析及其與類胡蘿卜素含量、總抗氧化能力的關(guān)系的研究，初步分析Vg基因免疫相關(guān)功能及其作用機(jī)理。主要結(jié)果如下：
　　1、Vg基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆。采用同源克隆結(jié)合RACE-PCR的方法，首次克隆得到華貴櫛

3、孔扇Vg基因的全長(zhǎng)cDNA序列，全長(zhǎng)7760bp，共編碼2289個(gè)氨基酸殘基。取21個(gè)物種做同源分析發(fā)現(xiàn)，櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)和蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)顯示出更近的親緣關(guān)系，先匯成一支后與華貴櫛孔扇貝匯聚，之后依次與其它海洋貝類、昆蟲(chóng)、蝦、蟹等節(jié)肢動(dòng)物聚類，最后與脊椎動(dòng)物類聚。
　　2、VgmRNA時(shí)空表達(dá)分布。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)VgmRNA在不同組織不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水

4、平變化，結(jié)果顯示，VgmRNA具有組織表達(dá)特異性和性腺發(fā)育水平相關(guān)性。VgmRNA在卵巢中大量表達(dá)，在精巢及其他組織中只有痕量表達(dá)；VgmRNA在生長(zhǎng)期表達(dá)水平較高，在成熟期顯著下降，在排卵后期又恢復(fù)到較高水平。
　　3、Vg與類胡蘿卜素含量、總抗氧化能力的關(guān)系。通過(guò)對(duì)卵巢VgmRNA表達(dá)水平、類胡蘿卜素含量及總抗氧化能力的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)VgmRNA表達(dá)水平與類胡蘿卜素含量，VgmRNA表達(dá)水平與總抗氧化能力、類胡蘿卜素含量與總抗氧化

5、能力之間存在顯著的(P<0.05)正相關(guān)性。
　　4、VgmRNA在感染實(shí)驗(yàn)中的變化。在雌性個(gè)體的性腺中注射17β-雌二醇，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其可以誘導(dǎo)VgmRNA的表達(dá)，證明17β-雌二醇可以促進(jìn)華貴櫛孔扇貝Vg的合成。通過(guò)對(duì)華貴櫛孔扇貝進(jìn)行鰻弧菌感染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Vg在鰻弧菌感染24h內(nèi)出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，表明Vg對(duì)華貴櫛孔扇貝應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染有一定相關(guān)性，可能起到免疫防御的功能。由于類胡蘿卜素可以通過(guò)干擾代謝或基因互作在

6、基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)，我們推測(cè)類胡蘿卜素在Vg行使免疫防御功能的時(shí)候起著重要作用。
　　本研究首次獲得華貴櫛孔扇貝Vg基因全長(zhǎng)cDNA序列，同時(shí)研究了VgmRNA空間表達(dá)特性，為今后開(kāi)展Vg基因表達(dá)與調(diào)控的研究提供了理論依據(jù)；本研究首次將VgmRNA表達(dá)水平和類胡蘿卜素含量及總抗氧化性聯(lián)系起來(lái)，給Vg免疫功能的研究提供了新角度；Vg作為一種具有免疫活性的分子，在軟體動(dòng)物的非特異性免疫中能夠發(fā)揮作用，這也為探索貝類新的免疫途徑，改善貝類