日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)卵黃蛋白原代謝相關(guān)基因的克隆和表達(dá)研究.pdf

1、日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)又名青蝦、河蝦,是我國重要的經(jīng)濟(jì)淡水蝦。近年來,隨著其自然資源的銳減和養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大,養(yǎng)殖的日本沼蝦出現(xiàn)了生產(chǎn)性能下降和種質(zhì)資源退化的情況,其中蝦個(gè)體小型化和“性早熟”的現(xiàn)象尤為突出?！靶栽缡臁奔创?、雄性個(gè)體性腺提前發(fā)育,造成了商品蝦的規(guī)格降低,繁殖性能下降,嚴(yán)重影響了日本沼蝦的品質(zhì)和產(chǎn)值,成為日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一大瓶頸。與精巢相比,卵巢發(fā)育需要消耗更多的營養(yǎng),使得雌性個(gè)體的

2、“性早熟”對日本沼蝦的養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的負(fù)面影響更大。造成雌性個(gè)體“性早熟”的因?yàn)樯形赐耆槊?有學(xué)者從養(yǎng)殖外部環(huán)境條件和營養(yǎng)調(diào)控的角度進(jìn)行了探討,但均未涉及到卵巢發(fā)育提前啟動(dòng),即雌性“性早熟”的機(jī)理,查明蝦的卵巢發(fā)育機(jī)制將為解決這一生產(chǎn)難題提供理論基礎(chǔ)參考。
　　 甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育過程中最顯著的變化是卵母細(xì)胞直徑的劇烈增大,這主要是由于卵巢內(nèi)卵黃蛋白(yolk protein)等營養(yǎng)物質(zhì)大量積累所致。甲殼動(dòng)物卵黃蛋白的前體物質(zhì)卵黃蛋

3、白原(vitellogenin,Vg)在卵子發(fā)育之初即啟動(dòng)合成,合成后在體內(nèi)被水解為卵黃蛋白沉積在卵母細(xì)胞中。有關(guān)甲殼動(dòng)物Vg的合成和水解過程的影響和調(diào)控機(jī)制至今不十分清楚,但卵生脊椎動(dòng)物這一過程的研究已做了大量細(xì)致的工作。卵生脊椎動(dòng)物Vg的合成受體內(nèi)外多種激素和多肽的調(diào)控,其中熱休克蛋白90(heat shock protein90,HSP90)和環(huán)境類雌激素雙酚A(BPA)和雌激素受體結(jié)合,誘導(dǎo)體內(nèi)Vg合成,Vg合成后在水解酶的作用

4、下水解為卵黃蛋白,組蛋白酶L(canthepsin L,CL)和組蛋白酶B(Canthepsin B,CB)在這一水解過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　 本研究借助分子生物學(xué)和生物信息學(xué)手段,首次克隆獲得日本沼蝦Vg基因cDNA片段、HSP90、CL和CB基因cDNA全長,分別命名為MnVg、MnHSP90、MnCL和MnCB。并測定了上述基因在日本沼蝦不同組織中、卵巢發(fā)育過程中及不同劑量BPA浸泡暴露下mRNA表達(dá)量的變化。研究結(jié)

5、果將為闡明日本沼蝦“性早熟”的產(chǎn)生過程,以及采取有效的控制手段提供必要的參考。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1、克隆獲得567bp的日本沼蝦MnVg片段,該序列共編碼183個(gè)氨基酸；這183個(gè)氨基酸序列與羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)Vg蛋白的相似性高達(dá)95％,與朝鮮長額蝦(Pandalus hypsinotus)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)、日本囊對蝦(M

6、arsupenaeus japonicus)、刀額新對蝦(Penaeus monodon)Vg蛋白的相似性分別為76％、52％、52％、51％；不同組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)結(jié)果顯示:MnVg mRNA在日本沼蝦鰓、肌肉、血細(xì)胞、心臟、胸神經(jīng)節(jié)和腸中均有表達(dá),胸神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)量最高；卵巢和肝胰腺中Vg表達(dá)量隨著卵巢的發(fā)育逐步升高,當(dāng)卵巢發(fā)育至次級卵黃發(fā)生期(Ⅳ期)時(shí)MnVg的表達(dá)量達(dá)到最大值,而且在卵巢發(fā)育過程中肝胰腺內(nèi)MnVg

7、的表達(dá)量顯著高于卵巢內(nèi)的表達(dá)量(p<0.05)。上述結(jié)果表明:日本沼蝦MnVg合成既有內(nèi)源性又有外源性,且以外源性的合成為主,肝胰腺是日本沼蝦MnVg的主要合成器官。
　　 2、動(dòng)物受到外界刺激,如熱刺激等,體內(nèi)HSP90會(huì)大量合成,但是近年來的研究結(jié)果表明,HSP90不僅與熱休克等刺激有關(guān),而且在卵生脊椎動(dòng)物的卵巢發(fā)育過程中也具有重要的作用。雌二醇缺乏時(shí),HSP90和雌二醇受體結(jié)合,從而促進(jìn)Vg蛋白合成。本研究應(yīng)用簡并引物通過

8、RACE法成功克隆了日本沼蝦MnHSP90基因cDNA全長序列。該序列全長2,684 bp,其中包括126 bp5’-UTR,2,199 bp ORF和359 bp3’-UTR(序列號:GU319963),ORF編碼732個(gè)氨基酸,該蛋白的分子量為84.3KDa。序列比對結(jié)果顯示MnHSP90氨基酸序列與其它動(dòng)物HSP90氨基酸序列具有很高的相似性(72％-79％)。qPCR測定結(jié)果顯示,MnHSP90基因在日本沼蝦胸神經(jīng)節(jié)中表達(dá)量最高

9、,顯著高于其它組織(肌肉、腸、鰓和血細(xì)胞)(p<0.05),為其他組織的2-10倍；不同組織中,肌肉、腸、鰓中的表達(dá)量均較高,顯著高于雌蝦和雄蝦血細(xì)胞中的表達(dá)量(p<0.05)。卵巢和肝胰腺中的MnHSP90表達(dá)量隨著卵巢發(fā)育逐步升高,分別在初級卵黃發(fā)生期(Ⅲ期)和次級卵黃發(fā)生期(Ⅳ期)達(dá)到最大值。在卵巢整個(gè)發(fā)育過程中,肝胰腺中的MnHSP90表達(dá)量顯著高于卵巢(p<0.05)。上述結(jié)果不僅表明MnHSP90與日本沼蝦的卵巢發(fā)育有關(guān),而

10、且進(jìn)一步證明了肝胰腺是日本沼蝦卵黃蛋白原主要的合成器官,同時(shí)表明胸神經(jīng)節(jié)在日本沼蝦卵巢發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　 3、在日本沼蝦的BPA安全濃度(12.06mg/L)上下范圍內(nèi),采用等對數(shù)的方法設(shè)定了5個(gè)暴露濃度組:5.01mg/L、7.76mg/L、12.056mg/L、18.62mg/L和28.84mg/L,將日本沼蝦分別浸泡暴露于上述濃度的BPA中,19d后測定其卵巢中MnVg和MnHSP90表達(dá)量的變化。測定結(jié)果

11、顯示MnVg和MnHSP90基因的表達(dá)量隨著BPA濃度的上升,先增加后降低,12.06 mg/L組MnVg和MnHSP90基因的表達(dá)量最高。即低濃度的BPA促進(jìn)日本沼蝦卵巢MnVg和MnHSP90基因的表達(dá),高濃度則抑制日本沼蝦卵巢MnVg和MnHSP90基因的表達(dá)。
　　 4、為了研究日本沼蝦卵黃蛋白原的水解過程,本研究在日本沼蝦卵巢EST序列的基礎(chǔ)上,通過RACE法成功克隆了日本沼蝦MnCL和MnCB基因全長cDNA序列。<

12、br>　　 序列分析結(jié)果表明,MnCL序列含有31 bp的5’-UTR,1029 bp的ORF和650 bp的3'-UTR(序列號:HM134078)。ORF共編碼342個(gè)氨基酸,此多肽N端具有18個(gè)氨基酸的信號肽和61個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽,成熟肽具有253個(gè)氨基酸,理論pI為5.25,分子量為37.7KDa。MnCL蛋白與斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)、黃粉蟲(Tenebrio molitor)和玉米象(Sitophilus

13、zeamais)CL蛋白相似性分別為73％、66％和66％。MnCL在測定的各組織(胸神經(jīng)節(jié)、心臟、鰓、腸)中的表達(dá)量均較高,顯著高于雌蝦血細(xì)胞中的表達(dá)量(P<0.05)。在測定的各組織中,心臟和肌肉中表達(dá)量最高,顯著高于其它組織(P<0.05)。在卵巢的發(fā)育過程中,肝胰腺中MnCLmRNA的表達(dá)量始終高于卵巢。卵巢中的MnCLmRNA的表達(dá)量隨著卵巢的發(fā)育逐步升高,當(dāng)卵巢發(fā)育至次級卵黃發(fā)生期(Ⅳ期)時(shí),表達(dá)量達(dá)到最大值。肝胰腺中的Mn

14、CLmRNA表達(dá)量在卵黃發(fā)生前期(Ⅱ期)和次級卵黃發(fā)生期(Ⅳ期)時(shí)表達(dá)量較高,其中卵黃發(fā)生前期(Ⅱ期)表達(dá)量最高。
　　 序列分析結(jié)果表明,MnCB序列含有12 bp的5’-UTR,996 bp的ORF和702 bp的3'-UTR(序列號:HM134079)。ORF共編碼331個(gè)氨基酸,此多肽N端含有16個(gè)氨基酸的信號肽和40個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽,成熟肽具有247個(gè)氨基酸組成,理論pI為6.36,分子量為36.5KDa。MnCB蛋白

15、與斑節(jié)對蝦(P.monodon)、埃及斑蚊(Aedesaegypti)和玉米根葉甲(Diabrotica virgifer)CB蛋白相似性分別為84％、65％和64％。MnCB基因在心臟中表達(dá)量最高,肌肉、肝胰腺和胸神經(jīng)節(jié)中表達(dá)量次之,腸、鰓和血細(xì)胞中的表達(dá)量較低。MnCB的表達(dá)量在卵巢的發(fā)育過程中逐步升高,卵巢發(fā)育至初級卵黃發(fā)生期(Ⅲ期)MnCB的表達(dá)量顯著增加,次級卵黃發(fā)生期(Ⅳ期)表達(dá)量繼續(xù)增加,但是與初級卵黃發(fā)生期(Ⅲ期)表達(dá)量