長角血蜱卵黃蛋白單克隆抗體的制備和卵黃發(fā)生的研究.pdf

1、蜱類是專性吸血的外寄生動物，傳播多種人、畜疾病且具極強(qiáng)的繁殖力，對人類健康和畜牧業(yè)造成極大危害。蜱類生殖生理學(xué)是國際上研究的熱點領(lǐng)域，其中卵黃發(fā)生及其調(diào)控是該領(lǐng)域的核心內(nèi)容。 本研究以廣泛分布于我國的長角血蜱Haemaphysalis longicornis Neumann為研究對象，運用生物化學(xué)、免疫學(xué)、氣象色譜/質(zhì)譜等現(xiàn)代生物學(xué)及其交差學(xué)科的研究方法，首次制備出長角血蜱卵黃蛋白(vitellin，Vn)的單克隆抗體(mono

2、clonal antibody，McAb)，并對純化的抗體做了一系列鑒定；在此基礎(chǔ)上，采用雙抗體夾心ELISA法測定長角血蜱各時期中心脂肪體，外周脂肪體，血淋巴和卵巢中卵黃原蛋白(vitellogenin，Vg)或Vn的含量；純化出Vg，并對其理化性質(zhì)進(jìn)行了研究。上述研究對于深入闡明蜱類卵黃發(fā)生及其調(diào)控機(jī)理，揭示蜱類生殖生物學(xué)規(guī)律、適應(yīng)對策和生理調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。主要結(jié)果如下： 1、用長角血蜱Vn免疫BALB/c小鼠，

3、取免疫鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，經(jīng)3次克隆化篩選，獲得6株能穩(wěn)定分泌抗Vn的單克隆抗體，即1B5、2A7、2B8、2F2、3A1和3G1。 2、采用Sigma公司的mouse monoclonal antibody isotyping reagents測定抗體亞型，IB5，2B8和2F2亞型為IgGA；2A7亞型為IgG1；3A1和3G1亞型為IgG2a。 3、經(jīng)夾心ELISA和間接ELISA檢測，6株單克

4、隆抗體均具有高度特異性，效價均在1:105以上。 4、選取效價和特異性最好的1株抗體1B5進(jìn)行SDS-PAGE分析和親和力測定，測得1B5重鏈和輕鏈的分子量分別為58 kD和21 kD，親和常數(shù)為2.8993×10-6，具有很強(qiáng)親和力。 5、Westem免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)6株單抗均與Vn的8個亞基發(fā)生免疫反應(yīng)。 6、采用雙抗體夾心ELISA法測定長角血蜱各時期中心脂肪體，外周脂肪體，血淋巴和卵巢中Vg或Vn的含量

5、。結(jié)果表明，中心脂肪體和外周脂肪體均在飽血后2天產(chǎn)生Vg，血淋巴在飽血后2天也含有Vg，但含量相對較少，卵巢中直到飽血后4天才出現(xiàn)Vn，證明長角血蜱的卵黃發(fā)生是脂肪體合成Vg，并釋放到血淋巴，由發(fā)育中的卵母細(xì)胞選擇性攝取、加工成Vn，作為胚胎發(fā)育的營養(yǎng)來源。 7、長角血蜱Vg只有一種，是一種糖脂復(fù)合蛋白，相對分子質(zhì)量為487 kD，由7個亞基組成，亞基相對分子質(zhì)量分別為165 kD、134 kD、112 kD、80 kD、78