致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌相關(guān)特異蛋白的鑒定及其單克隆抗體的研制.pdf

1、鵝卵黃性腹膜炎，又稱為鵝蛋子瘟，是一種主要發(fā)生于產(chǎn)蛋種鵝，引起種鵝生產(chǎn)性能下降甚至死亡的疾病。該病主要是母鵝生殖系統(tǒng)尤其是輸卵管感染大腸桿菌出現(xiàn)炎癥，繼而成熟的卵子不能正常進(jìn)入輸卵管掉入腹腔中，導(dǎo)致卵黃性腹膜炎。如果該病不能及時發(fā)現(xiàn)并給予治療，輕的導(dǎo)致產(chǎn)蛋母鵝生產(chǎn)性能下降甚至絕產(chǎn)，嚴(yán)重的導(dǎo)致產(chǎn)蛋母鵝的死亡，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。自上世紀(jì)六十年代首次報道該病以來，我國江蘇、湖北、廣東、河南、安徽、廣西、四川等地都有相關(guān)診療與預(yù)防的報道。國外僅

2、少數(shù)學(xué)者對產(chǎn)蛋雞卵黃性腹膜炎及其共感染病原進(jìn)行了相關(guān)報道。本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探尋鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌特異性蛋白，希望能為揭示鵝卵黃性腹膜炎發(fā)生機(jī)理、為臨床預(yù)防和控制鵝卵黃性腹膜炎的發(fā)生提供重要的理論依據(jù)。
　　 1.致鵝卵黃性腹膜炎特異性蛋白的鑒定
　　 為了找出致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌的差異蛋白，本研究分別取致鵝卵黃性腹膜炎菌株G837、G803、G8107進(jìn)行蛋白質(zhì)分析，同時用致鵝肝周炎大腸桿菌菌株E0056

3、（0）、E0060、致雞敗血癥大腸桿菌菌株251作為對照，提取全菌蛋白進(jìn)行二維電泳(two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)，2-DE圖譜經(jīng)PDQuest8.0.1軟件分析后，發(fā)現(xiàn)了鵝蛋子瘟大腸桿菌菌株特異性的蛋白點42個，對差異顯著的25個點送南方醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果獲得了21個差異蛋白。運(yùn)用PCR和RT-PCR對其中11個蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增分析，結(jié)果表明，大多數(shù)蛋白在普通大腸桿菌中均存在

4、相同編碼基因，但30S核糖體蛋白S6(30SribosomalproteinS6，RPS6)僅在鵝源致病性大腸桿菌中特異性表達(dá)，KAS（Ⅰ）(3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein]synthase（Ⅰ）)僅在致鵝卵黃性腹膜炎的大腸桿菌中表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)提示，這兩種蛋白可能與致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌相關(guān)，該結(jié)果為進(jìn)一步研究鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌致病機(jī)理打下了基礎(chǔ)。
　　 2.RPS6蛋白的原核表達(dá)及純化

5、r>　　 根據(jù)二維電泳質(zhì)譜分析結(jié)果中提供的已發(fā)表的基因序列(登錄號:gi|218707811|ref|YP_002415330.1)，設(shè)計合成了一對針對RPS6的特異性引物，在上下游引物中分別添加了BamHⅠ和HindⅢ的酶切位點。用PCR的方法從致鵝卵黃性腹膜炎大腸桿菌中擴(kuò)增出了RPS6基因。將擴(kuò)增的目的片段克隆至pGEM-TEasy載體中，陽性克隆測序分析表明，目的基因長度為396bp，其與已報道的序列同源性為99.7％。

6、　　 用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pGEM-T-RPS6重組質(zhì)粒，獲得RPS6基因片段，然后連接至經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后的pET-32a(+)表達(dá)載體中，經(jīng)雙酶切鑒定后，將含有RPS6基因的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到EcoliDE3(BL21)感受態(tài)細(xì)胞中，篩選重組菌pET-32a(+)-RPS6/DE3，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果表明，構(gòu)建的重組蛋白His-RPS6在大腸桿菌中獲得了可溶性表達(dá)，分子量約為34k

7、Da，大小與預(yù)期相一致。用HisTrapFF鎳柱對His-RPS6融合蛋白進(jìn)行了純化，結(jié)果得到了純度很高的重組蛋白，為進(jìn)一步研究提供了條件。
　　 3.抗RPS6蛋白單克隆抗體的制備及鑒定
　　 利用大腸桿菌大量表達(dá)融合蛋白His-RPS6，并純化，將其作為抗原免疫BALB/C小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，以表達(dá)及純化后的融合蛋白His-RPS6和表達(dá)His的大腸桿菌超聲波裂解物分別作為包被抗原，通過間接EL

8、ISA方法平行篩選獲得了三株抗RPS6的單克隆抗體，分別命名為RPS6-2C2、RPS6-3B1和RPS6-5H7。Western-blot試驗證實，本研究所獲得的單克隆抗體均能與表達(dá)融合蛋白的His-RPS6反應(yīng)，識別分子量為34kDa特異性蛋白質(zhì)條帶，與表達(dá)His的非融合蛋白不反應(yīng);并且所獲得的單抗只與致鵝發(fā)病的大腸桿菌反應(yīng)，與非致鵝發(fā)病的大腸桿菌及非鵝源性大腸桿菌不反應(yīng)，證明我們所獲得的單抗的特異性很好，是鵝病原性大腸桿菌特異性的