人FOXP3蛋白及其單克隆抗體的制備和鑒定.pdf

1、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）是近年來(lái)免疫學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。其具有免疫無(wú)能和免疫抑制兩大特征，在維持機(jī)體免疫耐受和免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)方面具有非常重要的作用。CD4+ Treg除了高表達(dá)CD25（IL-2Rα鏈）外，還表達(dá)GITR（glucocorticoid-induced TNF receptor-related gene）、CTLA-4（cytotoxic T lymphocyte-ass

2、ociated antigen 4）、CD62L、CD45RB等分子。但是，這些分子在活化的CD4效應(yīng)T細(xì)胞也有表達(dá)。最近的研究表明，轉(zhuǎn)錄因子FOXP3特異地表達(dá)在Treg中，在Treg的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮十分重要的作用。因此，獲得高純度的FOXP3及其特異性單克隆抗體，為今后深入研究轉(zhuǎn)錄因子FOXP3在Treg中的發(fā)育和功能提供了基礎(chǔ)。 本文的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果包括： 1. 重組人Foxp3基因（HFoxp3）克隆、蛋白表

3、達(dá)與純化。利用RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）技術(shù)從人外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞克隆HFoxp3，用含GST（glutathione S-transferase）標(biāo)簽的pGEX-4T-1載體，構(gòu)建重組pGEX-HFOXP3質(zhì)粒。用異丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranaside，IPTG）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的pGEX-H

4、FOXP3表達(dá)載體的大腸桿菌BL21(DE3)，并以Glutathione Sepharose 4B純化GST-HFOXP3融合蛋白，通過(guò)EMSA（electrophoretic mobility shift assay）實(shí)驗(yàn)證實(shí)純化出來(lái)的融合蛋白具有生物學(xué)活性。 2. 抗HFXOP3單克隆抗體的制備及其特性研究。以純化獲得的重組HFXOP3免疫Balb/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)制備抗HFXOP3單克隆抗體。通過(guò)ELISA（enz

5、yme linked immunosorbent assay）篩選出穩(wěn)定分泌抗HFXOP3的兩株單克隆雜交瘤細(xì)胞株，并檢測(cè)出兩株單克隆抗體均為IgG1亞類，輕鏈為κ亞型。通過(guò)免疫印跡、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測(cè)了2株單克隆抗體2B3和4D8的特性。 綜上所述，應(yīng)用重組DNA技術(shù)、原核表達(dá)與純化的方法、單克隆抗體制備技術(shù)，成功獲得了具有生物學(xué)活性的GST-HFOXP3融合蛋白，并制備了2株特異性抗HFXOP3單克隆抗體2B3