OVA66蛋白的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備和鑒定.pdf

1、OVA66是本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用重組Cdna表達(dá)文庫(kù)血清學(xué)分析（SEREX）技術(shù)篩選人卵巢癌Cdna文庫(kù)得到的一種新的腫瘤相關(guān)抗原。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OVA66呈CT抗原的表達(dá)特點(diǎn)，主要表達(dá)于某些腫瘤細(xì)胞及睪丸組織中。OVA66基因高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，有利于細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究著重于兩方面工作：OVA66蛋白的原核表達(dá)和抗OVA66單克隆抗體的制備和鑒定。 （1）表達(dá)和純化OVA66融合蛋白。利用本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的pcDNA3.1

2、 -OVA66及含6×His的原核表達(dá)載體pET32b(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32b-OVA66。誘導(dǎo)大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)融合蛋白OVA66，發(fā)現(xiàn)融合蛋白主要以包涵體形式存在，將包涵體變性處理，獲得可溶性的融合蛋白，經(jīng)Ni-TED親和層析柱純化，然后用透析方法將融合蛋白復(fù)性并鑒定，融合蛋白純度可達(dá)90％。 （2）制備小鼠抗OVA66單克隆抗體并分析其生物學(xué)特性。以純化獲得的OVA66融合蛋白免疫BALB/c小鼠，利用聚

3、乙二醇將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合。以pET32b空載體表達(dá)蛋白為對(duì)照檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗OVA66抗體的分泌，篩選出兩株穩(wěn)定分泌抗OVA66抗體的細(xì)胞5F4和4G9。這兩株細(xì)胞分泌的抗體亞型均為IgG1，輕鏈為κ型。5F4抗體的親和力常數(shù)為2.96×1010L/mol，4G9抗體的親和力常數(shù)為0.40×1010 L/mol。Western blot結(jié)果證實(shí)這兩株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體針對(duì)OVA66蛋白的不同表位。應(yīng)用