鯉春病毒血癥病毒G蛋白的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備.pdf

1、鯉春病毒血癥(Spring Viraemia of Carp, SVC)是一種鯉科魚類的急性、出血性的傳染病,可引發(fā)多種鯉科魚類感染,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鯉春病毒血癥病毒(SVCV)囊膜上具有G蛋白,是病毒最主要的抗原表位,同時(shí)也與病毒內(nèi)吞密切相關(guān)。單克隆抗體(Monoclonal Antibody,mAb)是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗體,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高,能夠大量制備的特點(diǎn),在病毒的檢測(cè)方面具有廣

2、闊的應(yīng)用前景, OIE推薦的SVCV檢測(cè)方法是建立在單克隆抗體基礎(chǔ)。本文重組表達(dá)鯉春病毒G蛋白片段,并制備其特異性單克隆抗體。與全病毒抗原相比,以G蛋白為抗原制備的單克隆抗體有顯著地優(yōu)勢(shì),可簡(jiǎn)化準(zhǔn)備流程、提高陽(yáng)性率、縮短制備周期。目前尚無以重組SVCV-G蛋白制備單克隆抗體的先例。主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1、G蛋白的表達(dá)與純化。本章擴(kuò)增了SVCV G基因片段(63-1389bp),構(gòu)建pET-28a-G重組表達(dá)質(zhì)粒,實(shí)現(xiàn)了G蛋白

3、在大腸桿菌中高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在。這與張琳等的結(jié)果相符。通過變性、洗滌純化,獲得較純的變性蛋白,經(jīng)過透析復(fù)性后,達(dá)到免疫用蛋白抗原的要求。楊振慧等割膠回收包涵體,免疫新西蘭大白兔,成功制備出抗SVCV的多抗,表明G蛋白存在線性表位,這是本文以變性后的G蛋白制備單克隆抗體的依據(jù)。
　　2、抗SVCV-G蛋白單克隆抗體的制備。本文以復(fù)性蛋白為抗原免疫Balb/c小鼠,本文取免疫5次后的小鼠脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/

4、0融合,收獲300余株融合細(xì)胞,融合率約為50％。采取間接ELISA結(jié)合間接IFA的方法篩選出抗G蛋白的單抗,前者適合大批量篩選,縮小檢測(cè)范圍,后者驗(yàn)證單抗是否與天然病毒特異性反應(yīng)。最終篩選出2株穩(wěn)定分泌抗G蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1C5,2D5。
　　3、對(duì)兩株單抗1C5、2D5進(jìn)行特性分析。兩株單抗均屬于IgG亞型。其培養(yǎng)上清的效價(jià)達(dá)到1:2560和1:5120,效價(jià)較高;Western Blot在約51.6k