藍(lán)舌病病毒VP7和VP2蛋白的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備.pdf

1、藍(lán)舌病(Bluetongue，BT)是由藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起、侵害綿羊和牛等家畜、以高熱、白細(xì)胞減少、黏膜潰瘍性炎癥變化等為主要癥狀的反芻動(dòng)物傳染病。該病是由庫蠓等昆蟲媒介傳播的非接觸性傳染病，純種細(xì)毛羊?yàn)樽钜赘袆?dòng)物，平均死亡率為35％，最高可達(dá)80％。BTV血清型多達(dá)26個(gè)，且相互之間無有效交叉保護(hù);血清1型和16型在國內(nèi)較為流行。該病流行范圍廣，傳播速度快。2006年前BTV4在希臘、西班牙、法

2、國、葡萄牙等國大面積流行;2006年后BTV8在歐洲多國大規(guī)模爆發(fā)，造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。BT在我國被劃分為一類動(dòng)物疾病，同時(shí)也是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織規(guī)定的上報(bào)疫病。
　　BTV的基因組分為10個(gè)節(jié)段，主要編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP7)和4種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3/NS3a和NS4）。VP7蛋白是BTV的群特異性蛋白，由S7基因編碼，大小為349個(gè)氨基酸，位于病毒核衣殼的表面，各血清型之間VP7蛋白94％以上的氨基酸保

3、守;VP2蛋白是型特異性蛋白，由L2基因編碼，大小范圍在950到960個(gè)氨基酸之間，位于病毒外層衣殼，各血清型之間氨基酸序列變化范圍在22.7％到72.9％之間。本研究對8型BTV的VP7蛋白和4型、8型BTV的VP2蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，并在此基礎(chǔ)上制備了抗VP7和VP2蛋白的單克隆抗體，為后期建立血清學(xué)診斷方法提供物質(zhì)基礎(chǔ)，為防止口岸檢疫中新血清型的流入提供技術(shù)儲(chǔ)備。
　　根據(jù)GenBank中公布的BTV8 S7基因、BTV4 L

4、2基因和BTV8 L2基因序列合成基因，設(shè)計(jì)引物將BTV4和BTV8的L2基因各分為4A、4B、4C和8A、8B、8C三段，進(jìn)行原核表達(dá)。分別將S7基因和L2分段基因克隆到原核表達(dá)載體pET-28a（His標(biāo)簽）和pMAL-c5x（MBP標(biāo)簽）中構(gòu)建重組質(zhì)粒。陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21后以終濃度為1.0mmol/L的IPTG對其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定，重組蛋白His-VP7、Hi

5、s-4A、His-4B、His-4C、His-8A、His-8B、His-8C和MBP-VP7、MBP-4A、MBP-4B、MBP-4C、MBP-8A、MBP-8B、MBP-8C均已獲得表達(dá)。對帶有MBP標(biāo)簽的重組蛋白通過直鏈淀粉樹脂進(jìn)行純化，帶有His標(biāo)簽的重組蛋白采用切膠純化的方法進(jìn)行純化。
　　以純化的帶有His標(biāo)簽的重組VP7和VP2蛋白作為免疫原免疫6周齡BALB/c小鼠，利用體外細(xì)胞融合技術(shù)將免疫后小鼠的脾細(xì)胞與SP2

6、/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。以帶有MBP標(biāo)簽的純化后重組VP7和VP2蛋白作為檢測抗原，建立間接ELISA檢測方法篩選分泌抗VP7和VP2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。共獲得5株穩(wěn)定分泌抗BTV8 VP7蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為3D7、3F4、5C9、6B5和6D11;獲得3株穩(wěn)定分泌抗BTV4 VP2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞1G7、8G3、5E6和2株穩(wěn)定分泌抗BTV8 VP2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞2B8、3G11。

7、Western blot結(jié)果表明所獲得單克隆抗體均能與相應(yīng)的重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。間接免疫熒光試驗(yàn)和間接ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明，單抗3F4與BTV8發(fā)生特異性反應(yīng)，與茨城病病毒、赤羽病病毒、豬輪狀病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)。經(jīng)抗體亞類鑒定試劑盒鑒定，抗BTV8 VP7蛋白的單克隆抗體中，3D7、3F4、5C9、6D11的亞類均為IgG1，6B5的亞類為IgM;抗BTV4 VP2蛋白的單克隆抗體中，1G7、8G3的亞類為IgG1，5E6的亞類為