鵝細小病毒VP3基因的原核表達及其單克隆抗體的研制.pdf

1、小鵝瘟是由鵝細小病毒(GPV)引起的雛鵝的烈性傳染病，其傳染性強，致死率高，病程短且死亡率極高，對養(yǎng)鵝業(yè)危害嚴重。1956年，方定一等在揚州首先發(fā)現(xiàn)本病，并于1961年用鵝胚分離到本病病原，隨后國內(nèi)外學者對小鵝瘟進行了大量研究并取得一定進展。對鵝細小病毒的實驗室診斷，許多學者曾先后報道了不同方法，其準確靈敏的有效診斷手段直接影響著養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展。
　　 鵝細小病毒為細小病毒科、細小病毒屬成員，該病毒基因組為單股線性DNA，GenB

2、ank發(fā)表的鵝細小病毒B株核苷酸序列長5106bp，有三種結(jié)構(gòu)蛋白，其中，VP3結(jié)構(gòu)蛋白是GPV的主要衣殼蛋白，VP3含有GPV主要抗原決定簇成分，是GPV的主要免疫保護性抗原，能誘導機體產(chǎn)生中和性抗體，因此VP3基因編碼的VP3蛋白在小鵝瘟免疫防治和診斷中起重要作用，是研究基因工程疫苗的首選蛋白。本研究基于VP3的體外表達和其單克隆抗體的研制，致力于完善GPV感染的診斷技術(shù)，建立了雙抗體夾心ELISA方法，并分析所得單克隆抗體的抗原表

3、位區(qū)，為建立以表位為基礎(chǔ)的抗原抗體檢測方法奠定了基礎(chǔ)。
　　 1.鵝細小病毒VP3基因在大腸桿菌中的優(yōu)化表達
　　 本研究根據(jù)GenBank發(fā)表的鵝細小病毒B株全基因序列，針對VP3基因設(shè)計一對特異性引物，利用PCR技術(shù)擴增VP3基因，并將PCR產(chǎn)物按預定的閱讀框插入到原核表達載體pCold-TF中，獲得重組質(zhì)粒pCold-TF-VP3，大小為1605bp，與預期結(jié)果一致。將重組質(zhì)粒pCold-TF-VP3轉(zhuǎn)化大腸桿菌E

4、.coliBL21(DE3)獲得高效誘導表達，通過菌體裂解上清液進行SDS-PAGE分析，該重組菌可表達大小為106kDa的可溶性融合蛋白，經(jīng)免疫印跡分析該重組蛋白能被鼠抗GPV陽性血清特異識別，說明體外表達的融合蛋白有較好的反應(yīng)原性。
　　 2.抗GPV單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用
　　 采用PEG濃縮病毒，蔗糖梯度離心純化得到的鵝細小病毒液作為制備單克隆抗體的免疫原，免疫6周齡BALB/c雌性小鼠，4次免疫后制備免疫小

5、鼠脾細胞，與SP2/0骨髓瘤細胞融合，經(jīng)間接ELISA(以純化的病毒液和pCOLD-TF-VP3蛋白為篩選抗原)篩選出9株能分泌抗GPV的單克隆抗體，采用有限稀釋法進行三次亞克隆，最終獲得3株能穩(wěn)定分泌抗鵝細小病毒的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為1C4、1C6、3E8，單抗腹水的ELISA效價分別為1:128000、1:256000、1:64000。免疫印跡結(jié)果表明此單抗能與純化的鵝細小病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，而與DHV、DPV、ND

6、V無交叉反應(yīng)。由于單克隆抗體的高特異性及生物素-親和素系統(tǒng)(BAS)的靈敏性和穩(wěn)定性，將純化的3E8進行生物素標記并測得標記效價為1:256000，然后建立檢測GPV的雙抗體夾心ELISA方法，以單克隆抗體1C4為捕獲抗體，以生物素(biotin)標記的3E8株單克隆抗體為第二抗體，方陣檢測確定捕獲抗體的最佳濃度為2μg/mL，Biotin-3E8的最佳工作濃度為50ng/mL，GPV最低檢出量為88ng/mL。用建立的雙抗體夾心法檢測

7、15份有病變的組織病料，8份為陽性，和PCR擴增結(jié)果符合率為86.6％，說明了建立的BAS-ELISA可用于GPV感染的臨床診斷。
　　 3.抗GPV單克隆抗體的抗原表位分析
　　 本研究根據(jù)GenBank發(fā)表的鵝細小病毒B株全基因序列，將采用分段PCR方法擴增GPVVP3基因，共分為4個片段，分別命名為A、B、C、D，其對應(yīng)的氨基酸位點分別位于1～152aa、135～332aa、323～535aa、1～535aa，并分