藍(lán)舌病病毒VP7蛋白的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備.pdf

1、藍(lán)舌病(Bluetongue disease，BT)是由藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起，由庫蠓傳播的反芻動(dòng)物病毒性傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類動(dòng)物疫病。該病主要集中在各熱帶、亞熱帶和溫帶國家，給畜牧業(yè)造成巨大的損失。在藍(lán)舌病病毒編碼的各種蛋白質(zhì)中，VP7蛋白為群特異性抗原。VP7蛋白是藍(lán)舌病病毒主要的核心抗原，攜帶有群特異性抗原決定簇，能刺激被感染機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)的群特異性免疫反應(yīng)。因此，VP7基

2、因已成為BTV研究的熱點(diǎn)。本研究在克隆并鑒定藍(lán)舌病病毒VP7基因基礎(chǔ)上，進(jìn)行VP7蛋白的原核表達(dá)，并制備相應(yīng)單克隆抗體，為診斷試劑研制奠定了基礎(chǔ)。 1.藍(lán)舌病病毒VP7蛋白的原核表達(dá)及純化產(chǎn)物反應(yīng)原性鑒定 根據(jù)已發(fā)表BTV VP7基因序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物。利用RT-PCR方法擴(kuò)增BTV-5型毒株編碼群特異性抗原的VP7基因片段。將擴(kuò)增片段克隆至pGEM-T Easy載體中，構(gòu)建VP7基因重組載體。經(jīng)核苷酸序列測定，克

3、隆的基因片段長1050bp，為S7基因開放性讀碼框的全長序列，編碼349個(gè)氨基酸。將VP7基因片段連接至pET-DsbA、pET-GST和pET-His表達(dá)載體中，經(jīng)抗性篩選、PCR擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶分析，篩選獲得BTV VP7基因片段正向插入、有正確讀碼框的陽性克隆。陽性克隆質(zhì)粒在Ecoli BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，篩選到高表達(dá)重組載體pET-DsbA/VP7。鎳瓊脂糖凝膠親和層析分離重組載體pET

4、-DsbA/VP7表達(dá)的帶His標(biāo)簽的重組VP7蛋白。SDS-PAGE、Western blotting和ELISA實(shí)驗(yàn)表明，表達(dá)蛋白為融合蛋白，分子量約為63.2kDa，具有良好的群特異反應(yīng)原性。 2.藍(lán)舌病病毒VP7蛋白的單克隆抗體制備及鑒定 本研究通過BHK-21接種，增殖藍(lán)舌病病毒，將收獲的病毒液用甲醛滅活。用純化病毒免疫Balb/c小鼠，取免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。用ELISA試驗(yàn)篩選陽性株，采用