抗馬立克氏病病毒VP22蛋白單克隆抗體的研制及應(yīng)用.pdf

1、1馬立克氏病CVI988病毒VP22基因克隆與原核表達(dá) 以感染CVI988/Rispens疫苗株的雞胚成纖維細(xì)胞的DNA為模板，根據(jù)Genbank上公布的基因序列設(shè)計不同引物，用PCR擴(kuò)增VP22全基因及不同片段，分別命名為VP22、VP22T、VP22C、VP22H，并將各個基因片段，克隆入pGEX-6P-1中，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞。陽性菌經(jīng)測序正確后，按1：100比例接種2mLLB液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，再以1：100比例接

2、種10mL2×YT液體培養(yǎng)基，37℃200rpm搖3h后，加0.5mMIPTG；誘導(dǎo)5h后，終止培養(yǎng)，進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有VP22羧基端能夠得到高效可溶性表達(dá)，命名為VP22C-GST。同時，對表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在不同IPTG工作濃度的誘導(dǎo)下，表達(dá)產(chǎn)物均呈高效可溶性表達(dá)。將表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠獲得的多抗進(jìn)行IFA和Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GST-VP22C有免疫原性，為VP22單抗制備和功能研究奠定了基礎(chǔ)。

3、 2抗馬立克氏病病毒VP22蛋白特異性單克隆抗體的研制及其特性 VP22C與GST融合表達(dá)產(chǎn)物GST-VP22C經(jīng)SDS-PAGE，切取特異性條帶作為免疫原，經(jīng)腹腔免疫注射6周齡雄性Balb/c小鼠，0.3mL/只，10天一免。加強(qiáng)免疫3d后，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。用RB1B病毒感染CEF進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)反復(fù)篩選陽性克隆，并經(jīng)有限稀釋法3次亞克隆，結(jié)果獲得了5株特異性分泌抗馬立克氏病病毒V

4、P22蛋白的陽性雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為MDVVP22C-3F7、MDVVP22C-4E4、MDVVP22C-4E12、MDVVP22C-4A10、MDVVP22C-2E1。這5株單抗能與所有試驗(yàn)的MDV-1病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與其它常見禽病毒如新城疫病毒(NDV)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥病毒(REV)、禽腺病毒(Fowladenovirus)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)反應(yīng)。5株單抗的腹水IFA效價在1：6000-16000之間。

5、其中單抗3F7、4E12具有ELISA和Western-blot反應(yīng)性，且能與桿狀病毒表達(dá)的VP22反應(yīng)，而4E4、4A10、2E1無Western-blot效價，不可與桿狀病毒表達(dá)的VP22反應(yīng)，但能與COS-1暫態(tài)表達(dá)的VP22反應(yīng)。單抗在液氮中凍存半年后復(fù)蘇出來仍能穩(wěn)定地分泌抗VP22特異性抗體。這些單抗的研制為VP22蛋白功能的相關(guān)研究奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)。 3利用單克隆抗體研究VP22蛋白的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)功能 通過IFA，

6、利用制備的VP22特異性多抗和單克隆抗體4E4對CVI988病毒不同時間段感染的CEF，轉(zhuǎn)染VP22的COS-1細(xì)胞，VP22在細(xì)胞間的擴(kuò)散試驗(yàn)進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：除MDV感染CEF的空斑和轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞的核亮染外，空斑周圍正常細(xì)胞核、轉(zhuǎn)染細(xì)胞周圍的細(xì)胞核均有高度聚集VP22。這表明VP22可以高效轉(zhuǎn)導(dǎo)入所有細(xì)胞核中。而利用真核表達(dá)的蛋白觀察VP22在細(xì)胞間的擴(kuò)散試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，VP22可以攝入不同種類的所有細(xì)胞中，且定位于核內(nèi)。表明基