雞馬立克氏病病毒超強(qiáng)毒株RB1B pp38基因的真核表達(dá)及其特異性單克隆抗體的研制.pdf

1、根據(jù)Genbank發(fā)表資料，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增出雞馬立克氏病病毒超強(qiáng)毒株RB1B pp38基因，將PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T easy載體，經(jīng)限制性酶切分析和測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增到的pp38基因序列完全正確。用BamH I和Pst I酶將該基因片段從pGEM-T easy載體切下，回收目的DNA片段并與桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBac 1連接，篩選出重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac 1-pp38，轉(zhuǎn)座含有桿狀病毒穿梭質(zhì)粒的大腸桿菌

2、DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞后，獲得重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-pp38；將重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得了含有雞馬立克氏病病毒超強(qiáng)毒株RB1B pp38基因的重組桿狀病毒rBaemid-pp38(r pp38)。重組病毒感染Sf9細(xì)胞后，用IFA方法對(duì)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：構(gòu)建的重組桿狀病毒能夠在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)雞馬立克氏病病毒超強(qiáng)毒株RB1B pp38蛋白。 將表達(dá)雞馬立克氏病病毒超強(qiáng)毒株RB1B pp38蛋白的

3、昆蟲(chóng)細(xì)胞免疫BALB/C小鼠，取其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合。用丙酮乙醇固定液固定的感染了雞馬立克氏病病毒超強(qiáng)毒株RB1B的雞成纖維細(xì)胞CEF，通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，結(jié)果篩選出1株分泌抗MDV-PP38蛋白抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，命名為pp38-2F6，經(jīng)2次亞克隆后，100％雜交瘤細(xì)胞保持了分泌抗體的能力。間接免疫熒光試驗(yàn)證明，這一株單克隆抗體能與MDV-RB1B以及MDV-CVI988感染的