馬流感病毒NP蛋白的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備.pdf

1、馬流行性感冒（簡稱馬流感），是由正粘病毒科A型流感病毒屬中兩個抗原性不同的A型流感病毒亞型（H7N7曾稱為馬-1型；H3N8，曾稱為馬-2型）所引起的一種馬屬動物急性暴發(fā)式呼吸道疾病。馬流感傳播迅速，呈爆發(fā)性流行的特點(diǎn)，對養(yǎng)馬業(yè)，尤其賽馬業(yè)的危害最為嚴(yán)重。因此，快速、有效的進(jìn)行診斷及預(yù)防馬流感是非常重要的。
　　 本試驗(yàn)針對馬流感病毒核蛋白在進(jìn)化過程中變異率低、保守、具有型特異性，而且在病毒復(fù)制過程中，比其他結(jié)構(gòu)蛋白出現(xiàn)早，又是

2、細(xì)胞免疫的靶抗原，可產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)等特點(diǎn)，將其作為抗原捕捉ELISA的診斷抗原。
　　 本實(shí)驗(yàn)參照GenBank登錄號AY855342中的馬流感病毒NP基因序列，設(shè)計合成1對NP基因30～1095堿基序列的特異性引物，PCR擴(kuò)增NP基因，經(jīng)鑒定未發(fā)生突變和缺失，大小與預(yù)期結(jié)果一致為1086bp基因，將其克隆至原核表達(dá)載體pET32a中，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，

3、獲得與預(yù)測分子量為60Ku的融合蛋白（包含表達(dá)載體的蛋白大小為20Ku），經(jīng)Western blot及ELISA分析表明表達(dá)的融合蛋白具有良好的抗原性。將其純化后與弗氏佐劑充分乳化，作為抗原并免疫BALb/c小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)篩選后得到能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株4B12。
　　 本試驗(yàn)篩選一株針對馬流感NP蛋白特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株4B12，經(jīng)傳代、凍存和復(fù)蘇，均能穩(wěn)定分泌特異性抗體，為進(jìn)一