A型流感病毒HA DNA疫苗和原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及多克隆抗體制備.pdf

1、流行性感冒病毒(influenza virus，簡(jiǎn)稱(chēng)流感病毒)是流行性感冒(influenza，簡(jiǎn)稱(chēng)流感)的病原體。流感一直是引起人類(lèi)死亡的主要疾病之一，20世紀(jì)發(fā)生的4次全球性流感大流行給個(gè)人和社會(huì)造成無(wú)法估量的損失。而從1997年至今禽流感的肆虐更給人們敲醒了警鐘。流感病毒易突變，雖然目前科學(xué)技術(shù)突飛猛進(jìn)，但人類(lèi)至今仍無(wú)法征服流感。高效及安全的疫苗接種是預(yù)防流感的有效手段。核酸疫苗作為第三代疫苗，與傳統(tǒng)的滅活及減毒疫苗相比，其操作簡(jiǎn)

2、單、安全有效、可大規(guī)模生產(chǎn)并能同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液及細(xì)胞免疫，因此成為流感疫苗的研究熱點(diǎn)。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)和WHO都強(qiáng)調(diào)核酸疫苗是流感疫苗的一個(gè)重要研究方向，流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)基因的研究正是該重要研究?jī)?nèi)容之一。 流感病毒血凝素位于流感病毒包膜上，介導(dǎo)流感病毒吸附和穿入宿主細(xì)胞。HA是流感病毒最主要的表面抗原，它能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體以中和病毒的感染，產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，因此血凝

3、素在流感的診斷和防治中起重要作用。 本研究以HA為靶點(diǎn)研制DNA疫苗。我們首先通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增了流感病毒A/New Caledonia/20/99(H<,1>N<,1>)的HA基因并克隆入真核表達(dá)載體pVAX1中，構(gòu)建了DNA疫苗pVAX1/HA，為進(jìn)一步研究其免疫效力奠定了基礎(chǔ)。 為了確認(rèn)所構(gòu)建的DNA疫苗是否可在真核細(xì)胞中表達(dá)HA抗原，我們將DNA疫苗轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，并通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)HA的表達(dá)

4、，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了pVAX1/HA質(zhì)粒的細(xì)胞中可見(jiàn)綠色熒光，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pVAX1及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293T細(xì)胞均未出現(xiàn)熒光。此結(jié)果提示，DNA疫苗pVAX1/HA可在真核細(xì)胞中表達(dá)HA抗原。 為了進(jìn)一步研究注射DNA疫苗后，機(jī)體內(nèi)HA蛋白的組織分布及其免疫原性，大量制備HA抗原及抗HA抗體是十分必要的。因此我們構(gòu)建了pET-28a(+)/HA原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌BL21中通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，然后利用凝膠過(guò)濾層析對(duì)重組蛋