雞CVH基因截取片段的克隆、原核表達(dá)及其多克隆抗體制備.pdf

1、CVH(Chicken VASA Homolog)基因是VASA基因的同源基因，其表達(dá)的Cvh蛋白含有DEAD-box保守基序，具有RNA解旋酶活性，在生殖系細(xì)胞中特異性存在，對(duì)配子的形成起著決定性的作用。因此，CVH基因作為生殖系細(xì)胞的標(biāo)志基因，在胚胎干細(xì)胞(ES)和原始生殖細(xì)胞(PGC)的研究中用于鑒別和篩選生殖系細(xì)胞。
　　本研究旨在通過克隆雞CVH基因的片段，利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得His-Cvh融合蛋白，純化后作為抗原免疫新

2、西蘭大白兔制備抗CVH基因的多克隆抗體。利用Trizol法提取3周齡的雞睪丸中的總RNA，用RT-PCR擴(kuò)增CVH基因中640 bp的編碼序列，并將其克隆到pMD18-T載體上構(gòu)建pMD18-T-CVH重組質(zhì)粒。經(jīng)鑒定序列正確的陽(yáng)性質(zhì)粒，將其插入的目的基因亞克隆至pET-30a表達(dá)載體上，構(gòu)建pET-30a-CVH重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，用1mmol/L異丙基硫代β-D-半乳糖甘(IPTG)

3、37℃恒溫下誘導(dǎo)4hr.，使其表達(dá)目的蛋白，用SDS-PAGE與Western blot檢測(cè)和鑒定目的蛋白的表達(dá)。確定目的蛋白表達(dá)后，用8 mol/L尿素溶解蛋白，通過Ni-NTA親和層析柱對(duì)His-Cvh融合蛋白進(jìn)行純化。得到的純化蛋白與弗氏佐劑混合乳化后，分三次皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔，每次間隔3周。于第三次注射后第7天，心臟采血后收集血清，該血清即為制備的抗CVH基因多克隆抗體。最后通過分離的第5.5天的雞胚生殖嵴作為抗原，通

4、過Western blot檢測(cè)Cvh多克隆抗體的特異性。
　　結(jié)果表明:(1)本實(shí)驗(yàn)克隆了雞CVH基因ORF框中的640 bp編碼片段。該序列與雞CVH基因核苷酸序列(AB004836.1)和氨基酸序列的(BAB12337.1)同源性分別為99.5％和99.2％。(2)構(gòu)建了pMD18-T-CVH重組克隆載體和pET-30a-CVH重組表達(dá)載體;在優(yōu)化條件下，pET-30a-CVH重組質(zhì)?？稍贓.coli BL21(DE3)中高效