Hv1的原核表達(dá)、多克隆抗體制備及其在組織中表達(dá)的初步研究.pdf

1、電壓門控質(zhì)子通道廣泛存在于多種細(xì)胞與組織中,在生物體的生命活動(dòng)中發(fā)揮了重要的生理功能。尤其是在免疫系統(tǒng)中,電壓門控質(zhì)子通道發(fā)揮了關(guān)鍵作用。而人電壓門控質(zhì)子通道Hv1于2006年才從分子水平上得到確定,因此其功能方面的研究仍存在許多未知。本文用基因重組,克隆的方法構(gòu)建出Hv1的表達(dá)載體,并通過原核系統(tǒng)表達(dá)純化出Hv1蛋白,然后用純化的蛋白制備多克隆抗體。繼而通過免疫染色,免疫熒光的方法檢測其在大鼠腦缺血,人乳腺癌等組織中的表達(dá)情況。通過受

2、損的組織檢測,初步研究其在免疫系統(tǒng)中的作用。
　　 目的:
　　 1.表達(dá)純化出Hv1蛋白。
　　 2.用純化的蛋白制備出小鼠抗Hv1的多克隆抗體。
　　 3.通過抗體檢測Hv1在組織中的表達(dá)情況。
　　 方法:
　　 1.構(gòu)建原核表達(dá)載體,并經(jīng)酶切證實(shí)。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Hv1融合蛋白,將重組基因工程菌擴(kuò)大誘導(dǎo)表達(dá),用GST特異結(jié)合方法,分離純化蛋白。
　　 2.將純化的蛋白與弗氏

3、佐劑乳化,將其作為抗原免疫BALB/c小鼠,免疫四次,每次免疫間隔10天,獲得小鼠抗Hv1的多克隆抗體,并通過間接ELISA檢測多克隆抗體效價(jià)。
　　 3.建立SD大鼠的腦缺血模型,收集得到乳腺癌組織,制作SD大鼠大腦的冰凍切片,乳腺癌組織的石蠟切片。用免疫熒光的方法檢測其在腦缺血中的表達(dá)情況,同時(shí)進(jìn)行正常腦的免疫熒光實(shí)驗(yàn),與腦缺血進(jìn)行對(duì)比。通過雙染的方法檢測Hv1在腦缺血情況下的小膠質(zhì)細(xì)胞,星形膠質(zhì)細(xì)胞,和神經(jīng)元的表達(dá)情況。用

4、免疫組化的方法檢測Hv1在乳腺癌組織,正常乳腺組織,和乳腺增生組織中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功構(gòu)建Hv1蛋白表達(dá)載體,DNA電泳檢測表明構(gòu)建出Hv1的原核表達(dá)載體。
　　 2.表達(dá)并純化出Hv1蛋白,并通過SDS—PAGE驗(yàn)證所表達(dá)的蛋白為目的蛋白。純度高于99％。
　　 3.得到小鼠抗Hv1的多克隆抗體,抗體效價(jià)高于1:100000。
　　 4.Hv1在大腦缺血的情況下大量表達(dá),