OTU1在腎炎系膜細胞中表達的意義及其多克隆抗體的制備.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、前言:泛素-蛋白酶體途徑是調(diào)控細胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的一個重要途徑,它在很多細胞活動,包括細胞周期、信號傳導、DNA修復、受體功能、發(fā)育分化、炎癥反應中起調(diào)節(jié)作用。該途徑是一個受多種因素調(diào)控的可逆過程,這其中存在一些特異性的去泛素化蛋白酶的參與。去泛素化酶通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的泛素化降解過程而與體內(nèi)許多生理及病理過程有關,受到眾多學者關注。
   卵巢腫瘤相關蛋白酶(OTUs)是新近發(fā)現(xiàn)的一個去泛素化酶家族。它包括從酵母到哺乳動物高度保守的

2、OTU結(jié)構(gòu)域,含有約130氨基酸,具有活性半胱氨酸蛋白酶位點。其中OTU1是在體外首先被證實的具有去泛素化酶活性的OTU蛋白。近年來研究表明,OTU1在細胞內(nèi)具有多功能特性,除了參與蛋白質(zhì)泛素化的調(diào)節(jié)外,還在調(diào)控細胞分化及細胞增生方面發(fā)揮重要作用。OTU1基因定位于11q13.1染色體上,廣泛表達于人類多種組織內(nèi)。已有用RT-PCR和Western Blot的方法證明OTU1在腎臟組織內(nèi)表達的報道,但是其具體表達的細胞定位及作用尚不清楚

3、,與腎臟疾病的發(fā)生是否有關也無相關報道。
   飾膠蛋白聚糖(DCN)是一種小分子量的富含亮氨酸的蛋白聚糖,由核心蛋白和一條糖胺聚糖鏈構(gòu)成,前者分子量約40 kD,由10~12個富含亮氨酸重復序列的模體構(gòu)成,目前研究發(fā)現(xiàn)DCN有多種功能。本課題組前期實驗在腎小球疾病的病理研究中也證實,DCN可以影響腎小球系膜細胞(mesangial cell,MC)的TGF-β1的作用活性,在減少腎炎病變中腎小球ECM沉積、抑制MC增生及腎小球

4、纖維化硬化發(fā)展中起重要作用,是腎炎病變中一個重要的拮抗腎炎損傷的因子。近年來,對DCN代謝及調(diào)節(jié)研究也不斷深入。實驗表明,DCN的代謝有兩種方式。分泌到細胞外基質(zhì)中的DCN,可被纖維母細胞通過內(nèi)吞作用內(nèi)化后,經(jīng)溶酶體降解。而細胞內(nèi)的DCN在外界因素作用下,可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ER Stress),經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)節(jié)降解。本課題組前期實驗通過免疫共沉淀等方法,已證實MC內(nèi)DCN是通過泛素化蛋白酶體途徑降解的。同時,在DCN代謝的研究

5、中,我們從DCN免疫共沉淀蛋白的質(zhì)譜中又發(fā)現(xiàn)腎MC中去泛素化酶OTU1的表達,提示MC中OTU1可能與DCN結(jié)合,但目前還沒有這方面的研究報道。因此,進一步研究MC中OTU1是否影響DCN泛素化降解,對深入研究腎炎病變的機制是有重要意義的。
   本文我們應用基因重組OTU1質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大鼠MC,成功獲得OTU1高表達克隆株。并進一步應用RT-PCR及蛋白分析等實驗技術證實了MC中存在OTU1的表達,在炎癥因子刺激下OTU1表達

6、升高。同時,免疫組化染色也證實在以MC增生為主的人腎炎組織中,腎小球系膜區(qū)OTU1的表達明顯升高,提示OTU1表達與腎炎病理改變程度密切相關。在OTU1質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)MC中,OTU1高表達可促進MC中DCN的表達。免疫共沉淀顯示OTU1與DCN結(jié)合,并影響DCN的泛素化過程,提示OTU1是DCN泛素化過程的調(diào)節(jié)劑,以上結(jié)果表明MC中OTU1對DCN的表達影響可能在腎炎發(fā)病機制中發(fā)揮作用。
   同時,由于我們研究的早期還沒有商品化的抗

7、體,我們又嘗試應用原核誘導表達質(zhì)粒合成純化OTU1蛋白,并以微量淋巴結(jié)免疫法免疫新西蘭兔,制備了OTU1多克隆抗體。
   第一部分、OTU1真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及OTU1穩(wěn)轉(zhuǎn)MC克隆株的建立
   目的:構(gòu)建OTU1真核表達質(zhì)粒,篩選出穩(wěn)定高表達OTU1的大鼠MC克隆株,為進一步研究作準備。
   方法:用PCR法擴增OTU1基因片段,并連接到真核表達載體pIRES2-EGFP上;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α

8、;經(jīng)酶切測序鑒定;經(jīng)脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到大鼠MC中,通過G418及綠色熒光蛋白篩選出OTU1高表達的細胞克隆,并用RT-PCR和Western Blot進行鑒定。
   結(jié)果:PCR擴增出了850bp的OTU1目的基因片段,將其克隆到真核表達載體pIRES2-EGFP上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α內(nèi),經(jīng)酶切電泳及基因測序正確,構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pIRES2-EGFP-OTU1-myc。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后經(jīng)G418篩選,熒光顯微鏡下挑出了帶有

9、綠色熒光蛋白的克隆,Western Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染MC中可見明顯的Myc標簽蛋白的表達及OTU1蛋白表達水平升高,且OTU1mRNA水平明顯增高,獲得了穩(wěn)定高表達OTU1的MC克隆。
   結(jié)論:成功構(gòu)建了OTU1真核表達質(zhì)粒,并獲得了OTU1高表達的MC穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆株。
   第二部分、OTU1在腎炎系膜細胞中的表達及其與DCN的關系
   目的:探討OTU1在MC的表達及其與腎炎病理改變的關系,并研究MC中

10、OTU1對與DCN表達的影響。
   方法:培養(yǎng)大鼠和人MC;采用RT-PCR、Western Blot和免疫熒光的方法檢測細胞中OTU1的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達;采用Realtime PCR和Western Blot的方法觀察炎癥因子IL-1β和ATS刺激大鼠MC后,OTU1和DCN的mRNA和蛋白水平變化,并應用免疫組化對部分人腎炎活檢組織檢測了腎小球OTU1的表達分布;用Western Blot方法觀察轉(zhuǎn)染前后DCN蛋白變化;

11、采用免疫沉淀的方法檢測了MC內(nèi)OTU1是否與DCN結(jié)合及轉(zhuǎn)染前后MC內(nèi)DCN的泛素化水平變化。
   結(jié)果:在大鼠和人的MC中都有OTU1的mRNA和蛋白的表達,兩者表達的現(xiàn)象一致;IL-1β和ATS刺激大鼠MC3h、6h和12h后,OTU1和DCN的mRNA和蛋白水平升高;在人腎炎組織中,OTU1在以系膜增生性腎炎類型中表達明顯升高;OTU1基因轉(zhuǎn)染MC后,其過表達上調(diào)了大鼠系膜細胞中DCN的蛋白水平;免疫共沉淀證明OTU1可

12、以和DCN相互結(jié)合;與未轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染OTU1的大鼠系膜細胞中,DCN的泛素化降解減少。
   小結(jié):OTU1可在人與大鼠腎小球MC中表達且表達程度一致,表明動物與人的OTU1同源性非常相似;炎癥因子可刺激MC OTU1和DCN表達升高;人腎炎組織的腎小球系膜區(qū)OTU1表達升高,表明其表達與腎小球腎炎的病理改變有一定的相關性;基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大鼠MC后OTU1過表達可引起MC中DCN蛋白水平升高,免疫共沉淀證明OTU1與DCN相互

13、結(jié)合,并引起DCN泛素化降解減少,結(jié)果提示OTU1可能是MC中DCN代謝降解的調(diào)節(jié)因子,并可能與腎炎的發(fā)生機制相關。
   第三部分、OTU1多克隆抗體的制備
   目的:制備抗OTU1多克隆抗體,初步探討其在腎小球組織內(nèi)的表達
   方法:采用PCR方法擴增OTU1基因片段;將其連接到原核表達載體pProExHTa上;將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosette;酶切測序鑒定;利用誘導劑異丙基硫代半乳糖苷(IPT

14、G)進行誘導表達;用針對His標簽的Ni2+-NTA親和純化柱進行OTU1蛋白純化;經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western Blot分析驗證;將純化的蛋白采用微量淋巴結(jié)注射方法免疫新西蘭兔;用瓊脂雙擴散和間接ELISA方法測兔血清效價;采用Western Blot檢測其特異性;用自制的抗血清免疫組織化學方法檢測OTU1在腎組織的表達情況。
   結(jié)果:PCR擴增了850bp的OTU1基因片段,將其克隆到原核表達載體pProExH

15、Ta并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosette內(nèi),經(jīng)酶切電泳及基因測序正確,構(gòu)建了原核表達載體pProExHTa-OTU1,經(jīng)IPTG誘導和Ni2+-NTA純化后,用SDS-PAGE和Western Blot證實獲得了36KD的OTU1融合蛋白,將其免疫新西蘭兔后,獲得了高效價1:16000的兔抗血清,Western Blot證明OTU1抗血清是特異的,免疫組化結(jié)果證實用自制抗血清能在腎臟組織檢測到OTU1蛋白的表達。
   小結(jié):利用基因

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