OTU1在腎炎系膜細(xì)胞中表達(dá)的意義及其多克隆抗體的制備.pdf

1、前言：泛素-蛋白酶體途徑是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的一個重要途徑，它在很多細(xì)胞活動，包括細(xì)胞周期、信號傳導(dǎo)、DNA修復(fù)、受體功能、發(fā)育分化、炎癥反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用。該途徑是一個受多種因素調(diào)控的可逆過程，這其中存在一些特異性的去泛素化蛋白酶的參與。去泛素化酶通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的泛素化降解過程而與體內(nèi)許多生理及病理過程有關(guān)，受到眾多學(xué)者關(guān)注。
　　 卵巢腫瘤相關(guān)蛋白酶(OTUs)是新近發(fā)現(xiàn)的一個去泛素化酶家族。它包括從酵母到哺乳動物高度保守的

2、OTU結(jié)構(gòu)域，含有約130氨基酸，具有活性半胱氨酸蛋白酶位點(diǎn)。其中OTU1是在體外首先被證實(shí)的具有去泛素化酶活性的OTU蛋白。近年來研究表明，OTU1在細(xì)胞內(nèi)具有多功能特性，除了參與蛋白質(zhì)泛素化的調(diào)節(jié)外，還在調(diào)控細(xì)胞分化及細(xì)胞增生方面發(fā)揮重要作用。OTU1基因定位于11q13.1染色體上，廣泛表達(dá)于人類多種組織內(nèi)。已有用RT-PCR和Western Blot的方法證明OTU1在腎臟組織內(nèi)表達(dá)的報(bào)道，但是其具體表達(dá)的細(xì)胞定位及作用尚不清楚

3、，與腎臟疾病的發(fā)生是否有關(guān)也無相關(guān)報(bào)道。
　　 飾膠蛋白聚糖(DCN)是一種小分子量的富含亮氨酸的蛋白聚糖，由核心蛋白和一條糖胺聚糖鏈構(gòu)成，前者分子量約40 kD，由10～12個富含亮氨酸重復(fù)序列的模體構(gòu)成，目前研究發(fā)現(xiàn)DCN有多種功能。本課題組前期實(shí)驗(yàn)在腎小球疾病的病理研究中也證實(shí)，DCN可以影響腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cell，MC)的TGF-β1的作用活性，在減少腎炎病變中腎小球ECM沉積、抑制MC增生及腎小球

4、纖維化硬化發(fā)展中起重要作用，是腎炎病變中一個重要的拮抗腎炎損傷的因子。近年來，對DCN代謝及調(diào)節(jié)研究也不斷深入。實(shí)驗(yàn)表明，DCN的代謝有兩種方式。分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中的DCN，可被纖維母細(xì)胞通過內(nèi)吞作用內(nèi)化后，經(jīng)溶酶體降解。而細(xì)胞內(nèi)的DCN在外界因素作用下，可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER Stress)，經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)節(jié)降解。本課題組前期實(shí)驗(yàn)通過免疫共沉淀等方法，已證實(shí)MC內(nèi)DCN是通過泛素化蛋白酶體途徑降解的。同時，在DCN代謝的研究

5、中，我們從DCN免疫共沉淀蛋白的質(zhì)譜中又發(fā)現(xiàn)腎MC中去泛素化酶OTU1的表達(dá)，提示MC中OTU1可能與DCN結(jié)合，但目前還沒有這方面的研究報(bào)道。因此，進(jìn)一步研究MC中OTU1是否影響DCN泛素化降解，對深入研究腎炎病變的機(jī)制是有重要意義的。
　　 本文我們應(yīng)用基因重組OTU1質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大鼠MC，成功獲得OTU1高表達(dá)克隆株。并進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR及蛋白分析等實(shí)驗(yàn)技術(shù)證實(shí)了MC中存在OTU1的表達(dá)，在炎癥因子刺激下OTU1表達(dá)

6、升高。同時，免疫組化染色也證實(shí)在以MC增生為主的人腎炎組織中，腎小球系膜區(qū)OTU1的表達(dá)明顯升高，提示OTU1表達(dá)與腎炎病理改變程度密切相關(guān)。在OTU1質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)MC中，OTU1高表達(dá)可促進(jìn)MC中DCN的表達(dá)。免疫共沉淀顯示OTU1與DCN結(jié)合，并影響DCN的泛素化過程，提示OTU1是DCN泛素化過程的調(diào)節(jié)劑，以上結(jié)果表明MC中OTU1對DCN的表達(dá)影響可能在腎炎發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。
　　 同時，由于我們研究的早期還沒有商品化的抗

7、體，我們又嘗試應(yīng)用原核誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒合成純化OTU1蛋白，并以微量淋巴結(jié)免疫法免疫新西蘭兔，制備了OTU1多克隆抗體。
　　 第一部分、OTU1真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及OTU1穩(wěn)轉(zhuǎn)MC克隆株的建立
　　 目的：構(gòu)建OTU1真核表達(dá)質(zhì)粒，篩選出穩(wěn)定高表達(dá)OTU1的大鼠MC克隆株，為進(jìn)一步研究作準(zhǔn)備。
　　 方法：用PCR法擴(kuò)增OTU1基因片段，并連接到真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP上；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α

8、；經(jīng)酶切測序鑒定；經(jīng)脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到大鼠MC中，通過G418及綠色熒光蛋白篩選出OTU1高表達(dá)的細(xì)胞克隆，并用RT-PCR和Western Blot進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果：PCR擴(kuò)增出了850bp的OTU1目的基因片段，將其克隆到真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α內(nèi)，經(jīng)酶切電泳及基因測序正確，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-OTU1-myc。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后經(jīng)G418篩選，熒光顯微鏡下挑出了帶有

9、綠色熒光蛋白的克隆，Western Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染MC中可見明顯的Myc標(biāo)簽蛋白的表達(dá)及OTU1蛋白表達(dá)水平升高，且OTU1mRNA水平明顯增高，獲得了穩(wěn)定高表達(dá)OTU1的MC克隆。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了OTU1真核表達(dá)質(zhì)粒，并獲得了OTU1高表達(dá)的MC穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆株。
　　 第二部分、OTU1在腎炎系膜細(xì)胞中的表達(dá)及其與DCN的關(guān)系
　　 目的：探討OTU1在MC的表達(dá)及其與腎炎病理改變的關(guān)系，并研究MC中

10、OTU1對與DCN表達(dá)的影響。
　　 方法：培養(yǎng)大鼠和人MC；采用RT-PCR、Western Blot和免疫熒光的方法檢測細(xì)胞中OTU1的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)；采用Realtime PCR和Western Blot的方法觀察炎癥因子IL-1β和ATS刺激大鼠MC后，OTU1和DCN的mRNA和蛋白水平變化，并應(yīng)用免疫組化對部分人腎炎活檢組織檢測了腎小球OTU1的表達(dá)分布；用Western Blot方法觀察轉(zhuǎn)染前后DCN蛋白變化；

11、采用免疫沉淀的方法檢測了MC內(nèi)OTU1是否與DCN結(jié)合及轉(zhuǎn)染前后MC內(nèi)DCN的泛素化水平變化。
　　 結(jié)果：在大鼠和人的MC中都有OTU1的mRNA和蛋白的表達(dá)，兩者表達(dá)的現(xiàn)象一致；IL-1β和ATS刺激大鼠MC3h、6h和12h后，OTU1和DCN的mRNA和蛋白水平升高；在人腎炎組織中，OTU1在以系膜增生性腎炎類型中表達(dá)明顯升高；OTU1基因轉(zhuǎn)染MC后，其過表達(dá)上調(diào)了大鼠系膜細(xì)胞中DCN的蛋白水平；免疫共沉淀證明OTU1可

12、以和DCN相互結(jié)合；與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染OTU1的大鼠系膜細(xì)胞中，DCN的泛素化降解減少。
　　 小結(jié)：OTU1可在人與大鼠腎小球MC中表達(dá)且表達(dá)程度一致，表明動物與人的OTU1同源性非常相似；炎癥因子可刺激MC OTU1和DCN表達(dá)升高；人腎炎組織的腎小球系膜區(qū)OTU1表達(dá)升高，表明其表達(dá)與腎小球腎炎的病理改變有一定的相關(guān)性；基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大鼠MC后OTU1過表達(dá)可引起MC中DCN蛋白水平升高，免疫共沉淀證明OTU1與DCN相互

13、結(jié)合，并引起DCN泛素化降解減少，結(jié)果提示OTU1可能是MC中DCN代謝降解的調(diào)節(jié)因子，并可能與腎炎的發(fā)生機(jī)制相關(guān)。
　　 第三部分、OTU1多克隆抗體的制備
　　 目的：制備抗OTU1多克隆抗體，初步探討其在腎小球組織內(nèi)的表達(dá)
　　 方法：采用PCR方法擴(kuò)增OTU1基因片段；將其連接到原核表達(dá)載體pProExHTa上；將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosette；酶切測序鑒定；利用誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPT

14、G)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；用針對His標(biāo)簽的Ni2+-NTA親和純化柱進(jìn)行OTU1蛋白純化；經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western Blot分析驗(yàn)證；將純化的蛋白采用微量淋巴結(jié)注射方法免疫新西蘭兔；用瓊脂雙擴(kuò)散和間接ELISA方法測兔血清效價；采用Western Blot檢測其特異性；用自制的抗血清免疫組織化學(xué)方法檢測OTU1在腎組織的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：PCR擴(kuò)增了850bp的OTU1基因片段，將其克隆到原核表達(dá)載體pProExH

15、Ta并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosette內(nèi)，經(jīng)酶切電泳及基因測序正確，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pProExHTa-OTU1，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和Ni2+-NTA純化后，用SDS-PAGE和Western Blot證實(shí)獲得了36KD的OTU1融合蛋白，將其免疫新西蘭兔后，獲得了高效價1:16000的兔抗血清，Western Blot證明OTU1抗血清是特異的，免疫組化結(jié)果證實(shí)用自制抗血清能在腎臟組織檢測到OTU1蛋白的表達(dá)。
　　 小結(jié)：利用基因