人星狀病毒1型衣殼蛋白的序列分析、克隆表達(dá)及多克隆抗體制備.pdf

1、人星狀病毒（Human astrovirus，HAstV）是引起急性病毒性胃腸炎的常見致病原因之一。其包括8個(gè)血清型即人星狀病毒1型至8型，但以人星狀病毒1型(Human astrovirus serotype 1，HAstV-1)在世界范圍內(nèi)最為流行。HAstV-1的基因組長(zhǎng)度約6.8kb，是無(wú)包膜的單股正鏈RNA病毒，包括三個(gè)開放讀碼框架ORF1a、ORF1b、ORF2。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)顯示，由ORF2編碼的衣殼蛋白的主要結(jié)構(gòu)蛋白

2、之一-VP26片段，可能在病毒與細(xì)胞間相互作用過(guò)程中必不可少，而且該片段可能還包含中和及免疫反應(yīng)表位。
　　 本研究首先對(duì)11株來(lái)自不同地區(qū)HAstV-1的衣殼蛋白前體基因核苷酸、氨基酸序列進(jìn)行同源性比較并繪制進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)按地區(qū)差異可分為兩個(gè)基因組;再利用若干生物學(xué)分析軟件分析VP26片段的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性和抗原特征。然后利用原核表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中克隆、表達(dá)重組VP26蛋白并以NTA-Ni2+親和層析法純化重組蛋白，

3、運(yùn)用SDS-PAGE電泳、BCA試驗(yàn)、Western blot等方法對(duì)重組蛋白純度、濃度、抗原性進(jìn)行評(píng)價(jià)鑒定。以重組VP26蛋白作為抗原，免疫新西蘭大耳兔獲得多抗血清并對(duì)其效價(jià)、特異性用ELISA方法鑒定。
　　 結(jié)果表明:(1)原核表達(dá)載體pET30a(+)-VP26構(gòu)建成功，重組VP26蛋白可在大腸桿菌Rosetta2宿主菌中大量表達(dá)。(2)該重組VP26蛋白是研究VP26片段抗原性、生化特性、結(jié)構(gòu)功能的理想工具，可用于評(píng)價(jià)

4、該片段在免疫診斷和疫苗研制中的作用。(3)該原核表達(dá)、親和層析純化系統(tǒng)可用于滿足今后大規(guī)模疫苗制備和檢測(cè)試劑盒開發(fā)的需求，尤其是在應(yīng)用于檢測(cè)抗體的ELISA試劑盒包被抗原時(shí)，結(jié)果和成本要優(yōu)于使用全病毒。(4)免疫兔所得多抗血清效價(jià)達(dá)到1:8000可以滿足夾心法ELISA實(shí)驗(yàn)的需要。
　　 綜上所述，HAstV-1衣殼蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)建立和多克隆抗體制備可以作為今后相關(guān)研究的基礎(chǔ)，有助于對(duì)HAstV-1感染致病機(jī)理、免疫診斷和疫苗