真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的克隆、優(yōu)化、功能及多克隆抗體制備.pdf

1、真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(fugal immunomodulatory protein,FIP)是從一些高等擔子菌子實體中提取的與植物凝集素和免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和免疫功能相似的一類小分子蛋白質(zhì)。到目前為止,已分離得到了7種FIPs,即分別從赤芝(Ganoderma lucidum)、松杉靈芝(G.tsugae)、金針菇(Flammulina velutipes)、草菇(Volvariella volvacea)、紫芝(G.japoncium)、小

2、孢靈芝(G.microsporum)及紫芝(G.sinensis)中分離得到的LZ-8(FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo、FIP-gja、FIP-gmi及FIP-gsi。FIPs具有與凝集素相似的活性,能夠促進血細胞凝集。在免疫調(diào)節(jié)功能上,FIPs能夠促使淋巴細胞增殖,以及誘導淋巴細胞產(chǎn)生細胞因子。本論文利用同源克隆的方法,從赤芝(G.lucidum)、紫芝(G.sinensis)及金針菇(F.velut

3、ipes)中分別克隆到了真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因,并構(gòu)建原核表達載體pQE-FIP-glu、pQE-FIP-gsi及pQE-FIP-fve。將構(gòu)建的原核表達載體轉(zhuǎn)化進大腸桿菌(Escherichia coli) M15宿主細胞,通過使用IPTG誘導使其表達重組赤芝、紫芝及金針菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。利用Ni-NTA柱純化蛋白后,一方面用于多克隆抗體的制備;另一方面用于誘導小鼠脾細胞細胞因子表達實驗。SDS-PAGE實驗顯示,利用大腸桿菌成功表達

4、出了重組赤芝、紫芝及金針菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。Band Scan V5.0軟件分析顯示,表達的重組FIP-glu占大腸桿菌總蛋白的51.1％,其中可溶性重組FIP-glu占大腸桿菌總可溶性蛋白的55.4%,純化后其純度達到90%;表達的重組FIP-gsi占大腸桿菌總蛋白的41.7%,其中可溶性重組FIP-gsi占大腸桿菌總可溶性蛋白的46.1%,純化后其純度達到90%;表達的重組FIP-fve占大腸桿菌總蛋白的36.7%,其中可溶性重組F

5、IP-fve占大腸桿菌總可溶性蛋白的5.4%,純化后其純度達到90%。通過MALDI-MS證實,表達的蛋白為重組的赤芝、紫芝及金針菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。Western Blot實驗表明,表達的蛋白具有一定的免疫源性。將純化的重組赤芝、紫芝及金針菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白分別免疫新西蘭大耳白兔,從而獲得兔抗赤芝、紫芝及金針菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白多克隆抗體。利用間接ELISA法檢測多克隆抗體效價,其效價均達到了1:625,000。Western Blot

6、檢測多抗,結(jié)果顯示有明顯特異條帶。通過RT-PCR檢測,證實重組的赤芝、紫芝及金針菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白對小鼠脾細胞細胞因子的轉(zhuǎn)錄具有誘導作用。赤芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白及紫芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白能夠誘導細胞因子interleukin(IL)-2、IL-3、IL-4、interferon(IFN)-γ、tumour necrosis factor(TNF)-α及IL-2 receptor(IL-2R)的轉(zhuǎn)錄表達,金針菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白能夠誘導細胞因子

7、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、lymphotoxin(LT)及IL-2R的轉(zhuǎn)錄表達。本論文利用DNA改組技術(shù),對赤芝、紫芝及赤芝、金針菇、草菇這兩組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因進行改組初步研究。經(jīng)過兩輪PCR結(jié)果顯示,通過改組實驗,FIP基因在這兩組內(nèi)分別發(fā)生了基因片段的重組。得到的新基因分別包含了這兩組基因的基因片段,從而實現(xiàn)了DNA分子的體外重組。本論文利用染色體步移技術(shù),從金針菇基因組DNA中克隆到了一條長1 kb的真菌免疫

8、調(diào)節(jié)蛋白基因啟動子。在NCBI數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)有與該序列相同或相似的序列,因此該序列為一新的序列。對克隆到的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因啟動子序列進行生物信息學分析,結(jié)果顯示該序列含有多種基序。其中主要含有7個TATA-box、7個CAAT-box、1個G-box、1個ABRE、3個CGTCA-motif以及6個Skn-1 motif。預測轉(zhuǎn)錄起始位點位于ATG上游100 bp處。將該序列克隆到植物表達載體pCAMBIA1304中,利用根癌農(nóng)桿菌