植物病原真菌CYP51的克隆表達(dá)及多克隆抗體的制備.pdf

1、甾醇14α—去甲基化酶（也稱P45014DM，CYP51）是唯一的廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物中的細(xì)胞色素P450家族成員。它被視為最古老的細(xì)胞色素P450家族成員。它催化甾醇的14α—去甲基化反應(yīng)。甾醇14α—去甲基化酶是真菌麥角甾醇合成過程的關(guān)鍵酶。抑制真菌甾醇14α—去甲基化酶將會(huì)阻礙真菌麥角甾醇的合成。麥角甾醇的缺失會(huì)損害細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致真菌死亡。目前農(nóng)業(yè)上14α—去甲基化酶抑制劑（14α—demethylatio

2、n inhibitors，DMIs）類殺菌劑即是通過抑制真菌甾醇14α—去甲基化酶而發(fā)揮殺菌抑菌的作用。本文分別從柑橘綠霉菌和玉米黑粉菌中克隆柑橘綠霉菌CYP51 cDNA和玉米黑粉菌CYP51基因。本實(shí)驗(yàn)采用RT—PCR方法，從柑橘綠霉菌中成功克隆了柑橘綠霉菌CYP51 cDNA序列，成功構(gòu)建了柑橘綠霉菌CYP51重組表達(dá)載體pE28GL，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，SDS—PAGE分析表明，在58 kDa處有一特異性蛋白表達(dá)條帶。特異性蛋白

3、大小與文獻(xiàn)報(bào)道一致。重組蛋白表達(dá)量可達(dá)到菌體總蛋白的20％。在優(yōu)化條件下，重組柑橘綠霉菌CYP51蛋白經(jīng)Ni－NTA瓊脂糖親和層析柱一次純化后，SDS—PAGE分析表明，純化的目的蛋白基本上為單一譜帶。用純化重組柑橘綠霉菌CYP51蛋白免疫新西蘭白兔，成功制備了重組柑橘綠霉菌CYP51蛋白多克隆抗體。Western blot結(jié)果表明在58 kDa處檢測到特異性的雜交條帶。表明重組柑橘綠霉菌CYP51蛋白有較強(qiáng)的免疫學(xué)活性。同時(shí)本文從玉米