綿羊PAG3的表達(dá)及其多克隆抗體的制備.pdf

1、妊娠相關(guān)糖蛋白(pregnancy-associated glycoproteins，PAGs)是在哺乳動(dòng)物妊娠后胎盤胎兒子葉中分泌的一種酸性特異性糖蛋白，在家畜妊娠過程中發(fā)揮著重要的作用。通過利用PAGs的特異性識別對家畜進(jìn)行早期妊娠診斷，可以盡早的判斷是否妊娠以淘汰空懷母畜，獲得比B超檢測更為理想的效果。因此，PAGs對畜牧業(yè)的發(fā)展有著極其重要的意義。
　　本研究應(yīng)用原核表達(dá)生物工程技術(shù)制備綿羊妊娠相關(guān)糖蛋白(PAG3)，將獲

2、得的目的蛋白通過免疫家兔制備綿羊妊娠相關(guān)糖蛋白(PAG3)多克隆抗體，為進(jìn)一步對綿羊妊娠相關(guān)糖蛋白試劑盒的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。
　　根據(jù)GenBank登錄的綿羊PAG3基因序列，采用基因合成的方法合成PAG3序列并構(gòu)建pUC57-PAG3載體。使用PCR擴(kuò)增的方法獲得了帶有Nde1和Xho1酶切位點(diǎn)的綿羊PAG3編碼基因。然后將擴(kuò)增產(chǎn)物和pET20b載體分別進(jìn)行雙酶切，使用T4DNA連接酶將兩者連接，構(gòu)建pET20b-PA

3、G3質(zhì)粒，并將其接種到表達(dá)菌株BL21(DE3)感受態(tài)中。使用IPTG誘導(dǎo)劑對表達(dá)菌樣進(jìn)行誘導(dǎo)，通過對培養(yǎng)條件的不斷優(yōu)化，獲得融合His標(biāo)簽的綿羊PAG3。通過使用Ni-Agarose Resin親和層析柱對經(jīng)超聲波處理后的蛋白進(jìn)行純化獲得融合蛋白純品，使用SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)效果。使用獲得的帶有His標(biāo)簽的綿羊PAG3，等比例的與弗氏佐劑充分乳化混勻后，皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭白兔制備綿羊PAG3多克隆抗體。以獲得的融合H

4、is標(biāo)簽綿羊妊娠相關(guān)糖蛋白作為包被原，使用間接ELISA的方法對抗體效價(jià)進(jìn)行檢測，并使用Weatern Blot的方法檢測抗體血清的特異性結(jié)合能力。
　　本試驗(yàn)利用原核表達(dá)生物技術(shù)成功構(gòu)建了pET20b-PAG3載體。大腸桿菌表達(dá)菌株時(shí)，在37℃條件下的最佳表達(dá)條件是:IPTG誘導(dǎo)劑濃度為1 mmol/mL，誘導(dǎo)時(shí)間為4h。在此條件下獲得了融合His標(biāo)簽的綿羊PAG3，PAG3樣品的分子量大小為43kDa，與實(shí)際推算的相一致。使用