人SUMO-3基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建、多克隆抗體的制備.pdf

1、細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)控在分子水平表現(xiàn)為蛋白質(zhì)．蛋白質(zhì)相互作用的調(diào)節(jié)。此調(diào)節(jié)可部分通過可逆性蛋白質(zhì)共價(jià)修飾來進(jìn)行。SUMO(small ubiquitin-like modifier)是近年來發(fā)現(xiàn)的在結(jié)構(gòu)上類似于泛素的一類小分子蛋白質(zhì)修飾物，目前已發(fā)現(xiàn)有4種SUMO家族蛋白，SUMO-1，-2，-3,-4和至少50種SUMO修飾的底物被鑒定。SUMO通過與靶蛋白共價(jià)結(jié)合修飾廣泛參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄、核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與定位、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和維持基因組穩(wěn)定等功能。

2、 本試驗(yàn)以SUMO第二類家族成員SUMO-3為研究對象。我們首先通過PCR從pYFP-SUMO-3獲得SUMO-3GG，然后構(gòu)建了SUMO-3GG基因的原核表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒pET41a(+)-SUMO-3；構(gòu)建真核表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒pCMV-HA-SUMO-3、pCMV-Myc-SUMO-3、pEGFP-C1-SUMO-3、pDsRed-C1-SUMO-3。 將pET41 a(+)-SUMO-3轉(zhuǎn)化大腸桿菌表

3、達(dá)菌株BL21(DE3) plysS，IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果表明融合蛋白GST-SUMO-3在BL21(DE3)plysS中得到了高效表達(dá)，融合蛋白表觀分子量約為44.0 kDa。經(jīng)GST親和柱層析進(jìn)一步純化獲得了可溶性重組蛋白。以純化的融合蛋白GST-SUMO-3作為抗原免疫家兔制備多克隆抗體，并利用ELISA、Western blot檢測抗體的靈敏度和特異性。結(jié)果表明原核載體構(gòu)建成功，多

4、克隆抗體效價(jià)為1:6000;可以特異性識(shí)別內(nèi)源性SUMO-3蛋白。 將真核表達(dá)載體pEGFP-C1-SUMO-3利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，在熒光顯微鏡下觀察SUMO-3蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位。將真核表達(dá)載體pDsRed-C1-SUMO-3和pEGFP-C1-p53利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，在熒光顯微鏡下觀察蛋白的共定位情況。結(jié)果表明真核載體在Hela，細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)；SUMO-3蛋白