雞貧血病毒VP1基因的克隆、原核表達純化以及多克隆抗體的制備.pdf

1、雞貧血病毒(chicken anemia virus,CAV)是雞傳染性貧血病(Chicken infectiousanemia,CIA)的病原.CAV基因組共含有三個開放讀碼框,分別編碼VPl(51.6KD),VP2(24.0KD)和VP3(13.6KD)三種蛋白.其中VP1蛋白是CAV的唯一衣殼蛋白,而VP2是VP1的輔助蛋白,能幫助VP1形成正確的構(gòu)象,二者相互協(xié)調(diào)才能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫保護作用.VP3,也稱調(diào)亡素,能引起細(xì)胞凋亡,

2、與CAV的致病性有關(guān).∶本課題第一部分在獲得CAV全基因組的基礎(chǔ)上,首先根據(jù)Genbank中CAV哈爾濱分離株基因組序列,設(shè)計出針對CAV VP1全長的引物和CAV VP1小片段(608bp)的引物,利用PCR方法從實驗室前期構(gòu)建好并測序正確的pUC18-CAV質(zhì)粒中擴增出VP1基因全長和VP1小片段(608bp),各自雙酶切后將全長和小片段基因按照正確的讀碼框克隆到原核表達載體pET 2ga(+)、pET41a(+)和pET32n(+

3、)上,得到含VP1基因全長的pET28a(+)重組子和含VP1小片段的pET28a(+)、pET41a(+)和pET32a(+)重組子,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞,并對經(jīng)抗生素初步篩選的重組子進行雙酶切鑒定和序列鑒定.將雙酶切鑒定正確并且測序結(jié)果與Genbank上VP1基因序列完全一致的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌BL21(DE3),28-37℃、1mMIPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達.經(jīng)SDS-PAGE和Western blottin

4、g檢測后發(fā)現(xiàn)含VP1基因全長和VP1小片段的pET28a(+)、pET41a(+)重組子誘導(dǎo)菌無明顯融合蛋白表達,而含VP1基因小片段的pET32a(+)重組子誘導(dǎo)菌有分子量約42kDa的融合蛋白表達,與預(yù)期分子量大小一致,并且表達蛋白大部分以包涵體形式存在. 利用目的蛋白的多聚組氨酸尾巴進行鑷柱親和層析純化融合蛋白,經(jīng)Westernblotting鑒定,融合蛋白與His單抗能夠結(jié)合.純化出的蛋白經(jīng)PBS透析后濃縮,進行SDS-

5、PAGE電泳,考馬斯亮藍染色后切膠.將切下含目的蛋白的膠用PBS溶解研成勻漿后液氮凍融三次,與佐劑乳化制備抗原免疫動物,以收獲抗血清,并利用得到的抗血清進行梯度稀釋作為一抗做蛋白質(zhì)印跡.利用經(jīng)1:200比例稀釋的抗血清作為一抗做的蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果顯示,在PVDF膜上特異性的顯示出了分子量約為42KD的蛋白條帶. 綜上所述,重組質(zhì)粒pET32a(+)-VP1'(608bp)能夠成功地在大腸桿菌表達菌BL21(DE3)中表達出目的蛋

6、白,而其它構(gòu)建的重組子未見明顯表達.所獲得的重組質(zhì)粒.pET32a(+)-VP1'表達的融合蛋白與預(yù)期大小相同.利用親和層析純化后的蛋白制備抗原,免疫動物獲得抗血清. 通過本課題第一部分的實驗,為后續(xù)制備單克隆抗體進而更精確的檢測雞傳染性貧血病提供了良好的抗原來源,也為研究VPl與其他CAV蛋白之間的相互關(guān)系奠定了基礎(chǔ). 另外,本課題的第二部分著重研究了雞貧血病毒間的同源重組.CAV的遺傳變異性是極其有限的,同源重組是C

7、AV進化的重要機制之一.因此研究清楚CAV間是否存在著同源重組、同源重組在CAV進化上有什么作用,是非常重要的.我們從Genbank中挑選了來自世界各地分離出的CAV全基因組序列共31個,對它們進行系統(tǒng)發(fā)生的分析,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,并使用SimPlot軟件推斷出疑似的重組序列,然后用bootscaning的方法來確定這些序列中是否真的存在同源重組.經(jīng)過上述研究我們首次發(fā)現(xiàn)了CAv的一個新的基因型,并且找到了序列AF999018可能的親本序