海州香薷金屬硫蛋白的原核表達(dá)純化及其多克隆抗體的制備.pdf

1、金屬硫蛋白（MT）是一類分子量較小、富含Cys的金屬結(jié)合蛋白，廣泛分布于生物界。近年來研究表明，金屬硫蛋白不僅參與體內(nèi)微量元素的儲存、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，還具有拮抗電離輻射，清除自由基以及重金屬解毒等作用。而植物金屬硫蛋白的發(fā)現(xiàn)相對較晚，研究表明，植物金屬硫蛋白可以通過其大量的Cys殘基螯合重金屬并清除活性氧，使植物免受氧化損傷。它還參與了植物的發(fā)育、胚胎發(fā)生、抵抗逆境脅迫等多種生理過程，因此對植物的生長非常重要。
　　 本研究旨在建立

2、海州香薷金屬硫蛋白的高效表達(dá)及純化體系，制備其多克隆抗體。根據(jù)已克隆的海州香薷金屬硫蛋白基因序列，設(shè)計并合成一對特異性PCR引物。以基因cDNA第一鏈為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得MT基因，并進(jìn)一步將之克隆在質(zhì)粒載體pGEM-T easy上。用限制性內(nèi)切核酸酶從該載體上切下目的基因，然后插入到表達(dá)載體pGEX-2T上獲得重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到分子量約為33kDa的GST-EhMT1融合蛋白。該融合蛋白

3、以可溶性和包涵體兩種形式存在?？扇苄缘鞍捉?jīng)GST親和樹脂純化后得到高純度的目的蛋白。以融合蛋白作為抗原免疫家兔制備得到多克隆抗體。本實驗取得如下研究結(jié)果：
　　 1.成功地將擴(kuò)增得到的目的基因EhMT1與克隆載體pGEM-T easy連接并轉(zhuǎn)化到宿主菌JM109中，構(gòu)建了重組克隆載體pGEM-T-EhMT1。
　　 2.構(gòu)建了EhMT1的原核表達(dá)載體pGEX-2T-EhMT1。序列分析表明，目的基因按正確的閱讀框架插入到

4、表達(dá)載體GST序列中。篩選出陽性重組體，表達(dá)的蛋白產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE證明EhMT1基因在大腸桿菌中成功得到了表達(dá)，其分子量約為33kDa.
　　 3.經(jīng)過優(yōu)化目的融合蛋白的表達(dá)條件后，得到了含量比較高的可溶性融合蛋白。該可溶性融合蛋白純化后得到單一的目的融合蛋白條帶。
　　 4.以目的融合蛋白作為抗原免疫成年家兔，獲得多克隆抗體。間接ELISA和Western blotting分析表明，我們獲得了高滴定度且特異性良好