狂犬病病毒P和M蛋白的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備.pdf

1、狂犬病為一種急性的侵害神經(jīng)系統(tǒng)的人畜共患疾病，可以使所有的溫血?jiǎng)游锔腥?，包括人在?nèi)。一旦感染出現(xiàn)腦脊髓炎癥狀后，死亡率100％?？袢≡诎l(fā)展中國家仍是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。由于市場上還沒有針對狂犬病病毒P和M蛋白的抗體出售，所以制備針對RV的P和M蛋白的抗體，對于進(jìn)一步研究P和M蛋白的功能十分必要。
　　 本研究使用PCR的方法從實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pMD-NSM（包含有全長P和M基因）中擴(kuò)增出ERA株RV的P和M基因，分別克

2、隆到pMD18-T載體中。再將P和M基因分別定向亞克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，把獲得的陽性重組表達(dá)質(zhì)粒pET-P和pET-M分別轉(zhuǎn)化原核表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，pET-P和pET-M分別表達(dá)出大小50KD和39KD左右的融合蛋白。SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的表達(dá)形式，發(fā)現(xiàn)P重組蛋白的表達(dá)主要以可溶的形式存在，而M重組蛋白則是以包涵體的形式表達(dá)。用Ni-NTA親和層

3、析在非變性條件下純化P蛋白，獲得較高純度的蛋白。同時(shí)用含不同濃度尿素的包涵體洗滌液初步洗滌純化M蛋白。Westernblot檢測結(jié)果表明表達(dá)的融合蛋白P和M均可被RV陽性血清識(shí)別，證明其具有良好的免疫原性。純化后的蛋白用于免疫小鼠制備多克隆抗體，Westernblot和間接免疫熒光驗(yàn)證制備抗體的特異性。Westernblot結(jié)果表明制備的抗RV的P和M蛋白的多克隆抗體可以識(shí)別RV中相應(yīng)的蛋白，這證實(shí)所制備的多克隆抗體有較好的特異性。間接