馬傳貧病毒中國株S2基因原核表達及多克隆抗體制備.pdf

1、馬傳染性貧血病毒（Equine infectious anemia virus，EIAV）是反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬成員之一，在基因組結(jié)構(gòu)和抗原性上與人艾滋病病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）十分相似，可以引起馬屬動物的一種重要傳染病，以貧血、持續(xù)感染、反復發(fā)熱為特征，終生持續(xù)感染。 EIAV是結(jié)構(gòu)最簡單的慢病毒，其基因組RNA包括三個結(jié)構(gòu)基因，依次為gag、pol和env此外還有三個輔助基因

2、tat、rev和S2。 Tat和rev基因存在于所有慢病毒，而S2基因目前僅存在于EIAV中。在EIAV感染馬體內(nèi)能夠持續(xù)檢測到S2蛋白抗體的存在，但其作用目前尚不完全清楚。對我國多株EIAV強毒株和疫苗株的S2基因核序列進行分析后發(fā)現(xiàn)，S2基因是強毒株和疫苗株之間差異最大的基因，核苷酸和氨基酸的差異率分別是4.1％和10.4％。同時國外已有報道，構(gòu)建，S2失活的致病性感染性分子克隆，其體外復制動力學指標沒有受到影響。但該感染性克隆的體

3、內(nèi)感染實驗發(fā)現(xiàn)，與親本病毒相比，缺失S2基因顯著降低了病毒的復制水平和致病性。以上結(jié)果提示EIAV的S2基因是影響病毒在體內(nèi)復制和致病特性的重要因素。因此，對S2相關生物學特性進行深入研究，有助于進一步了解EIAV的致病機理和機體對該病毒的免疫應答機制。本研究旨在為S2反向遺傳研究提供行之有效的檢測手段，并為S2蛋白的功能研究打下基礎。 本研究以EIAV感染性分子克隆pLGFD3—8為模板擴增S2基因，將其克隆于pMD-18T載

4、體，測序證明為EIAV S2基因陽性克?。╬MD-18T—EIAV—S2）。將S2基因克隆入pET—30a表達載體，構(gòu)建出S2基因的重組表達質(zhì)粒（pET—30a—EIAV—S2）。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用IPTG誘導后成功表達出與預期大小相符的約20kDa的融合蛋白，表達形式為包涵體。表達產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和樹脂純化后，得到了純度較高的帶有6×His標簽的目的蛋白。用所獲得的純化產(chǎn)物經(jīng)四次肌肉注射新西蘭白兔，制備兔抗S2多克隆