豬瘟病毒E2基因部分片段的克隆和原核表達及其抗體制備.pdf

1、E2蛋白是豬瘟病毒的跨膜結構糖蛋白，是最易發(fā)生變異的一種蛋白，能誘導感染動物產(chǎn)生保護性免疫和豬瘟病毒中和抗體，是一種免疫優(yōu)勢蛋白，其中A1、B、c區(qū)對介導中和抗體的產(chǎn)生很重要，用A1和B或A1和C的單抗可見協(xié)同中和反應。表達CSFV Brescia株E2蛋白重組偽狂犬病毒以及用親和層析法從昆蟲細胞中的基因工程E2蛋白均能保護免疫豬抵抗豬瘟病毒的感染，可以確定E2蛋白誘導的免疫反應足以保護免疫豬抵抗豬瘟病毒的感染。為制備豬瘟病毒E2蛋白的

2、抗體，研究E2基因表達產(chǎn)物在免疫檢測中的應用及E2蛋白的中和性抗原表位，我們進行了豬瘟病毒E2基因部分片段的克隆和原核表達。 首先根據(jù)GenBank中登錄的豬瘟病毒基因組序列，設計一對引物，利用聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)技術從本實驗室保存的重組質粒(PGEX-4T-1-PE2)中擴增出大小約為622bp的基因；經(jīng)單酶切鑒定，與已知的豬瘟病毒E2基因含有相同的Dra Ⅰ酶切位點。P

3、CR產(chǎn)物分離純化后連接到pMD18-T 載體，并轉化宿主菌DH5 α，經(jīng)菌液PCR篩選出陽性重組克隆PMD18-T-TE2，結果表明本實驗成功的克隆到豬瘟病毒TE2基因。 其次，根據(jù)所克隆的豬瘟病毒TE2基因序列和原核表達載體PGEX-4T-1多克隆酶切位點設計另一對引物，應用PCR技術從重組質粒PMD18-T-TE2中擴增出長約622bp的豬瘟病毒TE2基因，編碼包括CSFV E2囊膜糖蛋白主要抗原區(qū)域A、B、C和D。再將擴增

4、的豬瘟病毒TE2基因克隆到原核表達載體 PGEX-4T-1中，經(jīng)質粒 PCR和EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ雙酶切鑒定，篩選出陽性重組克隆，構建原核表達重組質粒PGEX-4T-1-TE2。然后將該重組質粒轉化大腸桿菌 (EcoliRosetta (DE3) BL21，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)表達出谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)與TE2的融合蛋白GST-TE2，融合蛋白的分子量約為47.0KD，與預期結果相符。通過優(yōu)化原核表達

5、條件，確定了原核表達的最佳誘導時間和誘導劑濃度。對表達蛋白的可溶性進行鑒定，結果表明表達產(chǎn)物GST-TE2融合蛋白以包涵體形式存在。我們用優(yōu)化的原核表達條件對含有PGEX-4T-1-TE2質粒的Rosetta(DE3)BL21菌進行大量誘導表達，反復凍融和超聲方法裂解誘導菌，用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法使包涵體充分溶解，F(xiàn)olin-酚法測定提取的融合蛋白 GST-TE2濃度約為 1.2mg/ml。應用提取的GST-TE2融合蛋白作為

6、抗原免疫小鼠制備鼠抗豬瘟病毒TE2多克隆抗體。瓊脂擴散實驗表明制備的多抗具有良好的反應性，ELISA實驗表明鼠多抗的有效稀釋度可達1：25600，免疫印記(Western-blotting，WB)實驗證實鼠抗豬瘟病毒GST-TE2多抗含有抗GST抗體和抗融合蛋白GST-TE2抗體。 綜上所述，本研究成功地克隆了豬瘟病毒TE2基因，成功構建了原核表達質粒PGEX-4T-1-TE2并進行了原核表達，提取了融合蛋白GST-TE2，并且