某豬場(chǎng)爆發(fā)豬瘟的診斷及其病毒E2基因表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、豬瘟(Classical swine fever,CSF)是豬的一種高度接觸性傳染病，以發(fā)熱和出血為主要特征。世界動(dòng)物衛(wèi)生織(OIE)將其列為16種A類(lèi)傳染病之一，我國(guó)亦將之列為一類(lèi)動(dòng)物傳染病。目前，CSF主要分布在亞洲、非洲、南美洲和歐洲的40多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。調(diào)查顯示，現(xiàn)階段 CSF仍是對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)威脅最大的疾病，我國(guó)是豬瘟流行較嚴(yán)重的國(guó)家，我省各地也時(shí)常有豬瘟發(fā)生，每年因豬瘟死亡的豬占飼養(yǎng)總數(shù)的3％～5％，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此對(duì)

2、豬瘟的快速診斷和防制仍然具有十分重要的意義。
　　2007年6月貴州銅仁某豬場(chǎng)爆發(fā)了疑似豬瘟的疫情，通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀(guān)察、病理剖檢變化、金標(biāo)卡檢測(cè)、兔體交互試驗(yàn)及RT-PCR實(shí)驗(yàn)診斷后確診為豬瘟。然后根據(jù)GenBank登錄的豬瘟病毒 shimen，C株的E2基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，采摘病死豬的血液、扁桃體、淋巴結(jié)、脾、腎等組織提取總 RNA，并進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，通過(guò)電泳檢測(cè)和測(cè)序后獲得預(yù)期目的DNA條帶，并將其純化

3、后與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化到 TOP10感受細(xì)胞中，在含 Amp的瓊脂培養(yǎng)基中加入 IPTG和X-gal誘導(dǎo)培養(yǎng)，挑選白色菌落培養(yǎng)抽提質(zhì)粒，用BamHI和HindⅢ酶切鑒定和測(cè)序后，將測(cè)序結(jié)果用DNAStar和DNAMAN軟件與GenBank登錄的豬瘟病毒shimen，C株進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比較及遺傳進(jìn)化關(guān)系分析，并繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明：該流行毒株與豬瘟病毒 shimen，C毒株的同源性為98.9％和94.9％

4、氨基酸同源性為99.7％和98.1％,而與鄰近省份流行毒株有一定差異，同時(shí)證明E2基因克隆成功。
　　在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，培養(yǎng)含pMD18-T-E2質(zhì)粒的陽(yáng)性菌落，提取pMD18-T-E2質(zhì)粒，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定純化后，分別與雙酶切的原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-32a(+)載體和真核表達(dá)載體 pcDNA3.1(+)，在T4連接酶作用下16℃連接過(guò)夜，然后分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞 BL21和TOP10中，涂布平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，