表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的甲病毒復(fù)制子載體疫苗的細(xì)胞免疫效果評(píng)價(jià).pdf

1、豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起豬的一種高度接觸性，致死性的傳染病，是養(yǎng)豬業(yè)面臨的最大的威脅之一，也是制約我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的最重要的疫病之一。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列入OIE疾病名錄(OIEListeddiseases)，為須申報(bào)的(notifiable)動(dòng)物傳染病，我國(guó)也將其列為一類(lèi)傳染病。我國(guó)主要通過(guò)接種豬瘟兔化弱毒疫苗(hogcholeralapinizedvirus，HCLV)來(lái)控制豬瘟，該苗具有很好的免疫效力和

2、安全性，但不能通過(guò)血清學(xué)方法對(duì)CSFV野毒感染豬和疫苗接種豬進(jìn)行鑒別診斷。該疫苗的使用在控制豬瘟的同時(shí)嚴(yán)重的影響了我國(guó)牲豬及豬制品的貿(mào)易，也不利于豬瘟的根除。研制新型的安全有效且能利用血清學(xué)方法對(duì)免疫豬和感染豬進(jìn)行區(qū)分的豬瘟標(biāo)記疫苗具有重要意義。 目前有多種新型的豬瘟標(biāo)記疫苗正在研制中，本實(shí)驗(yàn)室也構(gòu)建了基于甲病毒復(fù)制子載體、表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的新型豬瘟DNA疫苗(pSFV1CS-E2)，該苗可以保護(hù)豬只免受豬瘟強(qiáng)毒的攻擊，但在

3、攻毒前，免疫豬只的抗體水平并不高，這暗示了該疫苗可能可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，并且細(xì)胞免疫在豬瘟的保護(hù)性免疫中具有重要作用。本研究旨在驗(yàn)證甲病毒復(fù)制子DNA疫苗可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，并進(jìn)一步研究提高甲病毒復(fù)制子免疫效果的方法。 將豬瘟病毒E2基因插入到痘苗病毒穿梭載體，然后進(jìn)行同源重組，利用5'-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)加壓篩選和藍(lán)白斑篩選，構(gòu)建了表達(dá)E2蛋白的重組痘苗病毒，通過(guò)PCR、間接

4、免疫熒光試驗(yàn)和Westernblot對(duì)重組病毒進(jìn)行了驗(yàn)證。用重組痘苗病毒免疫小鼠后，檢測(cè)到了E2抗體的產(chǎn)生。該重組痘苗病毒可以進(jìn)一步用于加強(qiáng)復(fù)制子DNA疫苗免疫效果，也可以用于復(fù)制子疫苗細(xì)胞免疫效果的評(píng)價(jià)。 在pSFV1CS-E2的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了融合表達(dá)E2蛋白和偽狂犬病病毒(PRV)VP22蛋白的復(fù)制子DNA疫苗pSFV1CS-E2-UL49，然后將pSFV1CS-E2和pSFV1CS-E2-UL49免疫小鼠，用基于CFSE染

5、色的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、WST-8淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)分析了免疫小鼠的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，同時(shí)用細(xì)胞因子ELISA和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)試驗(yàn)檢測(cè)了免疫小鼠淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。結(jié)果顯示，與空載體pSFV1CS相比，pSFV1CS-E2和pSFV1CS-E2-UL49免疫小鼠都產(chǎn)生了抗原特異性的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子，其中pSFV1CS-E2-UL49免疫小鼠產(chǎn)生的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和更多細(xì)胞因子高于pSFV1CS-E2免疫小鼠。

6、 pSFV1CS-E2和pSFV1CS-E2-UL49都可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，并且pSFV1CS-E2-UL49誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫效果更強(qiáng)，但這兩種復(fù)制子疫苗誘導(dǎo)的抗體水平都比較低。為了進(jìn)一步提高此疫苗的體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答，我們先用甲病毒復(fù)制子DNA疫苗pSFV1CS-E2-UL49免疫小鼠后，再分別用pSFV1CS-E2-UL49、表達(dá)E2蛋白的重組腺病毒rAdV-E2和桿狀病毒表達(dá)的重組蛋白rE2進(jìn)行加強(qiáng)免疫。然后用間接ELISA和

7、阻斷ELISA檢測(cè)了不同免疫組合誘導(dǎo)的抗體水平；用CFSE淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和WST-8淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)了免疫小鼠的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)；用ICS試驗(yàn)檢測(cè)了抗原特異性細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞水平。結(jié)果顯示，與用pSFV1CS-E2-UL49加強(qiáng)免疫相比，利用rAdV-E2和rE2加強(qiáng)免疫可以明顯提高抗體產(chǎn)生水平，從rAdv-E2加強(qiáng)免疫小鼠脾中檢測(cè)到明顯高的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞。 為了進(jìn)一步在豬體上研究復(fù)制子DNA疫苗誘導(dǎo)的

8、細(xì)胞免疫效果及prime-boost免疫策略對(duì)細(xì)胞免疫的加強(qiáng)效果，利用活細(xì)胞染料CFSE對(duì)豬外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcellsPBMCs)進(jìn)行染色，用多克隆刺激劑刀豆蛋白A(ConA)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，初步建立了基于CFSE染色的豬淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)方法，利用該法可以在豬體上評(píng)價(jià)疫苗的細(xì)胞免疫效果。 本研究證明，表達(dá)CSFVE2蛋白的甲病毒復(fù)制子DNA疫苗可以誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫，PRVV