利用噬菌體展示技術(shù)鑒定豬瘟病毒E2蛋白抗原表位.pdf

1、豬瘟 (classical swine,fever,CSF) 是由豬瘟病毒 (Classical swine fever virus,CSFV) 引起的一種高度接觸性傳染病,幾乎遍及全世界(除北美洲和大洋洲外),死亡率高達(dá)80﹪～90﹪.該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列入OIE疾病名錄(OIE Listed diseases),為須申報(bào)的 (notifiable)動(dòng)物傳染病. 抗原表位,又稱抗原決定簇,是抗原分子抗原性的基礎(chǔ).

2、正確而詳細(xì)地繪制抗原表位圖譜對(duì)疾病的診斷、設(shè)計(jì)無毒副作用的多表位疫苗以及免疫治療試劑等具有積極的意義.為深入了解CSFV的抗原結(jié)構(gòu),便于設(shè)計(jì)科學(xué)合理的疫苗和診斷試劑,我們對(duì)CSFV石門株(Shimen株)E2蛋白進(jìn)行了抗原表位鑒定. 本研究首先利用噬菌體隨機(jī) 12 肽庫(kù)對(duì)CSFV Shimen 株 E2 蛋白單克隆抗體HQ06進(jìn)行了3輪篩選,獲得一致序列LFDGSNP,與E2蛋白氨基酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn),此一致序列與E2蛋白N-端的B

3、/C和A抗原區(qū)<'772>LFDGTNP<'778>序列具有很高的同源性.為了進(jìn)一步驗(yàn)證此基序是否為一表位,將多肽LFDGTNP與 GST 在原核系統(tǒng)中融合表達(dá),Western blot和ELISA結(jié)果顯示表達(dá)LFDGTNP 的融合蛋白可以被 HQ06 特異性識(shí)別,證實(shí)<'772>LFDGTNP<'775>確為抗原表位.由以上結(jié)果表明,<'772>LFDGTNP<'778>為CSFV Shimen株的一個(gè)保守的線性B細(xì)胞抗原表位,此表位

4、的鑒定對(duì)豬瘟病毒診斷研究具有一定的參考價(jià)值. 另外,本研究利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)了CSFV Shimen 和 CSFV HCLV株的E2蛋白.重組蛋白Shimen-E2 和 HCLIV-E2都是以二聚體的形式分泌表達(dá)于細(xì)胞培養(yǎng)液中,并且分子量存在差異.重組蛋白Shimen-E2和HCLV-E2均可被豬瘟病毒抗血清和豬瘟E2蛋白單克隆抗體HQ06所識(shí)別.定點(diǎn)突變分析表明,Shimen-2和HCLV-E2分子量大小差異是由

5、于在<'986>NYT(A)處糖基化位點(diǎn)的不同所致.用純化后的重組蛋白Shimen-E2作為免疫原,建立了一株特異性分泌E2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為6E10.此細(xì)胞株分泌的單克隆抗體可以特異性識(shí)別豬瘟病毒,但與變性的E2蛋白反應(yīng)很弱,初步推測(cè)單克隆抗體6E10可能是針對(duì)E2蛋白的構(gòu)象表位.利用噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)對(duì)單克隆抗體進(jìn)行3輪篩選,獲得9個(gè)噬菌體克隆,與單克隆抗體6E10均發(fā)生特異性反應(yīng),測(cè)序結(jié)果顯示,噬菌體克隆展示一致序列