噬菌體展示技術(shù)在GP Ⅱb-Ⅲa抗原表位篩選中的應(yīng)用.pdf

1、在該研究中,我們以GP Ⅱb／Ⅲa鼠單抗H7為隨機(jī)噬菌體十二肽庫的篩選靶標(biāo).H7單抗有很好的抑制血小板聚集的活性.從篩選出的結(jié)合肽,能分析可能的抗原表位,探討結(jié)合肽作為血小板自身抗體拮抗劑的可能性.這將為以后對GP Ⅱb／Ⅲa結(jié)構(gòu)和功能研究,GP Ⅱb／Ⅲa及其配基之間的相互作用以及研制血小板自身抗體拮抗劑提供一定幫助.抗血小板GP Ⅱb／Ⅲa鼠單抗H7 IgG由該所分子免疫研究室制備.我們采用噬菌體隨機(jī)十二肽庫篩選H7單抗的特異性肽配

2、基,用P／N比值評價(jià)特異性結(jié)合的噬菌體克隆的富集效果.經(jīng)過4輪的生物淘洗,P／N比值提高到約40倍,說明特異性結(jié)合的噬菌體克隆得到富集.從第4輪篩選結(jié)果中隨機(jī)挑選25個(gè)陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增和提取噬菌體單鏈DNA,然后測定核苷酸序列,共獲得6種序列.在間接ELISA實(shí)驗(yàn)中,設(shè)立無關(guān)噬菌體組作為非特異性吸附的對照組.用我們篩選到的6種序列噬菌體克隆,和H7單抗靶蛋白結(jié)合,隨后對噬菌體進(jìn)行顯色,測定反映結(jié)合力的OD值.間接ELISA實(shí)驗(yàn)證明這6種

3、噬菌體克隆都和靶蛋白特異性結(jié)合.隨后我們進(jìn)行了血小板膜蛋白的粗提純,用于噬菌體結(jié)合肽的競爭ELISA實(shí)驗(yàn).經(jīng)ELISA鑒定,證明我們獲得的血小板膜蛋白具有很好抗原抗體結(jié)合活性.綜合結(jié)合肽序列、ELISA、功能分析試驗(yàn)和計(jì)算機(jī)分析結(jié)果,我們認(rèn)為Ⅱb／Ⅲa蛋白上的2個(gè)位點(diǎn)Ⅱb：900-902aa（PSR）和Ⅲa：495-498aa（RPS）可能就是H7單抗作用的抗原表位所在區(qū)域,并且可能也是Ⅱb／Ⅲa蛋白的功能部位,這些還需今后進(jìn)一步研究證